Auswirkungen von Aronia auf Entzündungen und das Darmmikrobiom

Anthropometrie. Die Messungen wurden von den Teilnehmern unter Verwendung der validierten segmentalen multifrequenten bioelektrischen Impedanzanalyse (SECA mBCA 515, Hamburg, Deutschland) gesammelt. Zur Analyse wurden die Fettmasse (%) und das geschätzte viszerale Fett (L) verwendet.

Herausforderung für fettreiche Mahlzeiten. Die fettreiche Mahlzeit enthielt gesalzene Butter (58,3 g, Tillamook) über 3 Scheiben Vollkorntoast (127,5 g; Wheat Montana). Der Gesamtenergiegehalt der Mahlzeit betrug 714 kcal, davon 43,1 % aus Fett, mit einer Makronährstoffaufteilung von 50 g Fett, 54 g Kohlenhydraten und 12 g Protein. Wasser wurde mit der Mahlzeit bereitgestellt; koffeinhaltiger schwarzer Tee wurde stattdessen für Teilnehmer bereitgestellt, die sich als gewohnheitsmäßige Kaffeekonsumenten identifizierten.

Blutprobe. Die Teilnehmer wurden angewiesen, in den 24 Stunden vor ihrem Besuch auf Alkoholkonsum und anstrengende körperliche Aktivitäten zu verzichten und vor der Blutentnahme über Nacht (10 - 12 Stunden) zu fasten. Die Blutproben der Teilnehmer wurden von einer zertifizierten Krankenschwester oder einem Arzt morgens vor der Einnahme der Mahlzeit und stündlich für 4 Stunden nach der Einnahme der Mahlzeit entnommen, insgesamt zu fünf Zeitpunkten. Vollblut in Serumtrennröhrchen wurde 15 Minuten lang gerinnen gelassen, bevor es 15 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert wurde, wobei das resultierende Serum aliquotiert und bis zur Analyse bei –80°C gelagert wurde.

Bestimmung von Blutmarkern. Blutmarker des metabolischen Syndroms wurden aus Vollblut bestimmt, das auf Lipidpanels des Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, USA) lief. Seruminsulin (INS) wurde unter Verwendung eines Insulin-ELISA-Kits (MP Biomedicals, Solon, OH) bestimmt, das gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurde. Die Zytokinmessung wurde unter Verwendung von hochempfindlicher Multiplexing-Technologie (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) nach Verfahren von Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA) durchgeführt. Klassische systemische proinflammatorische Zytokine wurden gemessen und umfassen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Interleukin (IL)-1B, IL-6, Tumornekrosefaktor (TNF)-α. InterleukinI-17 und IL-23, die beide eine entzündungsfördernde und regulatorische Rolle in der Darmschleimhaut spielen, wurden ebenfalls gemessen. Serumproben wurden zu jedem Zeitpunkt während der Belastung mit fettreicher Mahlzeit doppelt durchgeführt.

Hockerprobensammlung. Entnahmekits wurden zur Verfügung gestellt und die Teilnehmer wurden gebeten, die enthaltenen Anweisungen für die Selbstentnahme einer Stuhlprobe in den 24 Stunden vor ihrem Blutentnahmebesuch zu befolgen. Nach der anfänglichen Entnahme in einer sterilen Einwegkommode wurde ein kleiner Teil der Probe in ein steriles Eppendorf-Röhrchen überführt und zu den Forschern transportiert. Die Proben wurden in einer anaeroben Kammer vorbereitet und aliquotiert, dann bis zur Analyse bei -80 °C eingefroren.

Genomische DNA-Extraktion und mikrobielle Analyse. Die Extraktion von Bulk-DNA aus Stuhlproben wurde unter Verwendung des Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) und Perlenschlagen durchgeführt. Die DNA wurde über Nacht an das Microbiome Project der University of Michigan, Michigan, zur Illumina MiSeq-Amplikonsequenzierung der 16S-rRNA-V4-Region versandt. Nach der DNA-Quantifizierung wurden V4-Amplikon-Bibliotheken mit Dual-Index-Barcode-Primern generiert, dann durch Bibliotheksreinigung, Pooling und MiSeq-Paired-End-Sequenzierung. Rohsequenz-Reads wurden mit der MOTHUR-Software (Version 1.35.1) verarbeitet und kuratiert. gemäß dem MOTHUR-Standardbetriebsverfahren für die MiSeq-Plattform39. Kurz gesagt, Paired-End-Reads wurden zu zusammenhängenden Sequenzen zusammengesetzt und auf Länge und Qualität gescreent. Die verbleibenden Contigs wurden mit der ribosomalen RNA-Datenbank von SILVA (Release 132), einer umfassenden Sammlung von ausgerichteten rRNA-Sequenzen, abgeglichen. Potenziell chimäre Sequenzen wurden unter Verwendung des UCHIME-Algorithmus in MOTHUR identifiziert und entfernt. Taxonomische Klassifikationen wurden unter Verwendung des Bayes'schen Klassifikators des Ribosomal Database Project zugewiesen. Nicht-Ziel-Reads wurden entfernt und operative taxonomische Einheiten (OTUs) wurden unter Verwendung von entfernungsbasiertem VSEARCH-Clustering bei einer Ähnlichkeitsschwelle von 97 % zugewiesen. Alpha- und β-Diversity-Indizes wurden unter Verwendung des veganen Pakets in R40 generiert. Für Teilnehmer des ppTG-Phänotyps wurde eine OTU-basierte Datenmatrix erstellt.

Metabolomische Analyse. Gefrorene Serumproben wurden aufgetaut und 20 μl wurden in ein sauberes Röhrchen gegeben. 80 μl Methanol von HPLC-Qualität wurden zu der Probe gegeben, wonach sie kurz gevortext wurde und für 2 Stunden in einen Gefrierschrank mit –80 °C gestellt wurde. Nach zwei Stunden wurde die Probe 10 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Der Metabolitenüberstand wurde gesammelt und in einem Speed ​​Vac bis zur Trockne eingeengt, während das Proteinpellet verworfen wurde. Die Proben wurden dann bei –80 °C gelagert, bis sie für die LCMS-Analyse bereit waren, wonach sie mit 40 μl Methanol:Wasser (50:50) rekonstituiert und in ein sauberes Massenspektrometrie-Fläschchen gegeben wurden. Die Analyse wurde auf einem Agilent 6538 Q-TOF MS durchgeführt, das mit einem Agilent 1290 UHPLC unter Verwendung einer 130 A, 1,7 μm, 2,1 mm x 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC-Säule gekoppelt war. Die Proben wurden über Elektrospray-Ionisation ionisiert und die Läufe wurden im positiven Modus abgeschlossen. Die mobile Phase A war 15 mmol/l Ammoniumformiat und die mobile Phase B war ACN unter Verwendung eines 10-40 % A-Gradienten über 6 Minuten. Der Durchfluss wurde bei 400 µl/Minute gehalten und die Säulenraumtemperatur wurde auf 30 °C eingestellt. Die MSMS-Analyse wurde unter Verwendung der gleichen LC-Bedingungen durchgeführt, während spezifische Ionen unter Verwendung von Retentionszeit und m/z-Werten aus früheren MS-Läufen abgezielt wurden. Nach Abschluss der LCMS-Analyse wurden die Rohdatendateien in .xml konvertiert Dateien mit MSConvert. Die Daten wurden dann mit mzMine unter Verwendung eines Intensitätsmindestwerts von 1.000 basierend auf einer visuellen Inspektion des Gesamtionenchromatogramms zum Entfernen von Rauschen abgebaut. Es wurden auch Blindproben analysiert und die resultierenden Merkmale wurden aus den biologischen Daten entfernt, wenn sie in einem Verhältnis von weniger als 5:1 in der Probe im Vergleich zur Blindprobe vorhanden waren. Die gewonnenen Daten wurden dann zur statistischen Analyse in MetaboAnalyst eingegeben. Tandem-MS-Daten wurden mit der Sirius-Software analysiert, um Merkmale zu identifizieren.