Impactos de Aronia na inflamação e no microbioma intestinal

Antropometria. As medições foram coletadas dos participantes usando a análise de impedância bioelétrica de multifrequência segmentar validada (SECA mBCA 515, Hamburgo, Alemanha). Massa gorda (%) e adiposo visceral estimado (L) foram utilizados para análise.

Desafio da refeição com alto teor de gordura. A refeição rica em gordura continha manteiga com sal (58,3 g, Tillamook) sobre 3 pedaços de torrada de trigo integral (127,5 g; Wheat Montana). O conteúdo energético total da refeição foi de 714 kcal, sendo 43,1% de gordura, com uma composição de macronutrientes de 50 g de gordura, 54 g de carboidrato e 12 g de proteína. A água foi fornecida com a refeição; em vez disso, o chá preto com cafeína foi fornecido para os participantes que se identificaram como consumidores habituais de café.

Amostra de sangue. Os participantes foram instruídos a evitar o consumo de álcool e atividade física extenuante nas 24 horas anteriores à visita e a completar um jejum noturno (10 a 12 horas) antes da coleta de sangue. Amostras de sangue dos participantes foram coletadas por uma enfermeira ou médico certificado pela manhã antes da ingestão da refeição e a cada hora por 4 horas após a ingestão da refeição, totalizando cinco pontos de tempo. O sangue total em tubos de separação de soro foi deixado coagular por 15 minutos antes da centrifugação a 1200 RPM por 15 minutos com o soro resultante aliquotado e armazenado a -80ºC até a análise.

Determinação de marcadores sanguíneos. Os marcadores sanguíneos da síndrome metabólica foram determinados a partir de sangue total em painéis lipídicos Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, EUA). A insulina sérica (INS) foi determinada usando um kit ELISA de insulina (MP Biomedicals, Solon, OH) realizado de acordo com as instruções do fabricante. A medição de citocinas foi realizada usando tecnologia de multiplexação de alta sensibilidade (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) seguindo os procedimentos da Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, EUA). Citocinas pró-inflamatórias sistêmicas clássicas foram medidas e incluem fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), interleucina (IL)-1B, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α. A interleucina I-17 e a IL-23, ambas com papel pró-inflamatório e regulador na mucosa intestinal, também foram medidas. As amostras de soro em cada ponto de tempo durante o desafio da refeição com alto teor de gordura foram executadas em duplicata.

Coleta de amostras de fezes. Os kits de coleta foram fornecidos e os participantes foram solicitados a seguir as instruções incluídas para a autocoleta de uma amostra de fezes nas 24 horas anteriores à visita de coleta de sangue. Após a coleta inicial em um vaso sanitário descartável estéril, uma pequena porção da amostra foi transferida para um tubo Eppendorf estéril e transportada para os pesquisadores. As amostras foram preparadas e aliquotadas em câmara anaeróbica e congeladas a -80ºC até a análise.

Extração de DNA genômico e análise microbiana. A extração de DNA a granel de amostras fecais foi realizada usando o Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) e batimento de esferas. O DNA foi enviado durante a noite para a Universidade de Michigan, Projeto de Microbioma de Michigan para sequenciamento de amplicon Illumina MiSeq da região 16S rRNA V4. Após a quantificação do DNA, as bibliotecas de amplicon V4 foram geradas com primers de código de barras de índice duplo, depois por purificação de biblioteca, agrupamento e sequenciamento MiSeq paired-end. As leituras de sequenciamento bruto foram processadas e selecionadas usando o software MOTHUR (versão 1.35.1) seguindo o procedimento operacional padrão MOTHUR para a plataforma MiSeq39. Em breve revisão, as leituras paired-end foram montadas em sequências contíguas e rastreadas quanto ao comprimento e qualidade. Os contigs restantes foram alinhados ao banco de dados de RNA ribossômico SILVA (Release 132), uma coleção abrangente de sequências de rRNA alinhadas. Sequências potencialmente quiméricas foram identificadas e removidas usando o algoritmo UCHIME em MOTHUR. As classificações taxonômicas foram atribuídas usando o classificador bayesiano do Ribosomal Database Project. As leituras não-alvo foram removidas e as unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram atribuídas usando agrupamento baseado em distância VSEARCH no limite de similaridade de 97%. Os índices de diversidade alfa e β foram gerados usando o pacote vegano no R40. Uma matriz de dados baseada em OTU foi construída para participantes incluídos no fenótipo ppTG.

Análise Metabolômica. As amostras de soro congeladas foram descongeladas e 20μL foram colocados em um tubo limpo. 80μL de metanol de grau HPLC foram adicionados à amostra, após o que foi brevemente agitado em vórtex e colocado em um freezer a -80 C por 2 horas. Após duas horas, a amostra foi centrifugada a 20.000g por 10 minutos. O sobrenadante do metabólito foi coletado e concentrado em um Speed ​​Vac até a secura, enquanto o sedimento de proteína foi descartado. As amostras foram então armazenadas a -80 C até estarem prontas para análise de LCMS, momento em que foram reconstituídas com 40μL de metanol:água (50:50) e colocadas em um frasco de espectrometria de massa limpo. A análise foi concluída em um Agilent 6538 Q-TOF MS acoplado a um Agilent 1290 UHPLC usando uma coluna Acquity BEH-HILIC HPLC de 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm. As amostras foram ionizadas por meio de ionização por eletropulverização e as execuções foram concluídas no modo positivo. A fase móvel A era 15mmol/L de formato de amônio e a fase móvel B era ACN usando um gradiente A de 10-40% durante 6 minutos. O fluxo foi mantido em 400 µL/minuto e a temperatura do compartimento da coluna foi ajustada para 30 C. A análise MSMS foi concluída usando as mesmas condições de LC enquanto direcionava íons específicos usando tempo de retenção e valores m/z de execuções MS anteriores. Após a conclusão da análise LCMS, os arquivos de dados brutos foram convertidos em .xml arquivos usando MSConvert. Os dados foram então extraídos com mzMine usando um valor mínimo de intensidade de 1.000 com base em uma inspeção visual do cromatograma de íons total para remover o ruído. As amostras em branco também foram executadas e as características resultantes foram removidas dos dados biológicos se presentes em uma proporção inferior a 5:1 na amostra em comparação com o branco. Os dados extraídos foram então inseridos no MetaboAnalyst para análise estatística. Os dados Tandem MS foram analisados ​​com o software Sirius para identificar características.