Воздействие черноплодной рябины на воспаление и кишечный микробиом

Антропометрия. Измерения были собраны у участников с использованием проверенного сегментарного многочастотного анализа биоэлектрического импеданса (SECA mBCA 515, Гамбург, Германия). Для анализа использовали массу жира (%) и расчетный висцеральный жир (L).

Вызов с высоким содержанием жиров. Мука с высоким содержанием жира содержала соленое масло (58,3 г, Тилламук) и 3 куска цельнозернового тоста (127,5 г, Пшеница Монтана). Общая энергетическая ценность блюда составила 714 ккал, из них 43,1% приходится на жиры, с раскладом макронутриентов: 50 г жиров, 54 г углеводов и 12 г белков. Воду давали вместе с едой; вместо этого участникам, которые идентифицировали себя как обычные потребители кофе, предлагался черный чай с кофеином.

Забор крови. Участники были проинструктированы избегать употребления алкоголя и напряженной физической активности за 24 часа до их визита и соблюдать ночное голодание (10-12 часов) перед забором крови. Образцы крови участников собирались сертифицированной медсестрой или врачом утром перед приемом пищи и ежечасно в течение 4 часов после приема пищи, всего пять временных точек. Цельной крови в пробирках для отделения сыворотки давали свернуться в течение 15 минут перед центрифугированием при 1200 об/мин в течение 15 минут с получением аликвот сыворотки и хранили при -80ºC до анализа.

Определение маркеров крови. Маркеры метаболического синдрома в крови определяли из цельной крови, анализируемой на липидных панелях Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, USA). Инсулин в сыворотке (INS) определяли с использованием набора инсулина ELISA (MP Biomedicals, Solon, OH) в соответствии с инструкциями производителя. Измерение цитокинов проводили с использованием технологии высокочувствительного мультиплексирования (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) в соответствии с процедурами Millipore (EMD Millipore Corporation, Биллерика, США). Были измерены классические системные провоспалительные цитокины, которые включают гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкин (IL)-1B, IL-6, фактор некроза опухоли (TNF)-α. Также были измерены интерлейкин I-17 и IL-23, оба из которых выполняют провоспалительную и регулирующую роль в слизистой оболочке кишечника. Образцы сыворотки в каждый момент времени во время провокации жирной пищей анализировали в двух экземплярах.

Сбор образцов стула. Были предоставлены наборы для сбора крови, и участников попросили следовать прилагаемым инструкциям по самостоятельному сбору образца стула за 24 часа до визита для сбора крови. После первоначального сбора в стерильный одноразовый туалет небольшая часть образца была перенесена в стерильную пробирку Эппендорфа и доставлена ​​исследователям. Образцы были приготовлены и разделены на аликвоты в анаэробной камере, затем заморожены при -80ºC до проведения анализа.

Экстракция геномной ДНК и микробный анализ. Экстракцию объемной ДНК из образцов фекалий проводили с использованием набора для выделения ДНК Powersoil (Mo Bio Laboratories, Inc.) и взбивания гранул. ДНК была отправлена ​​в течение ночи в Мичиганский университет, Мичиганский проект микробиома для секвенирования ампликона Illumina MiSeq области 16S рРНК V4. После количественного определения ДНК библиотеки ампликонов V4 были созданы с помощью праймеров со штрих-кодом с двойным индексом, затем путем очистки библиотеки, объединения и секвенирования парных концов MiSeq. Необработанные данные секвенирования обрабатывались и курировались с помощью программного обеспечения MOTHUR (версия 1.35.1). следуя стандартной рабочей процедуре MOTHUR для платформы MiSeq39. В кратком обзоре, чтения с парными концами были собраны в непрерывные последовательности и проверены на длину и качество. Остальные контиги были сопоставлены с базой данных рибосомных РНК SILVA (выпуск 132), полной коллекцией выровненных последовательностей рРНК. Потенциально химерные последовательности были идентифицированы и удалены с использованием алгоритма UCHIME в MOTHUR. Таксономические классификации были присвоены с использованием байесовского классификатора проекта Ribosomal Database Project. Нецелевые чтения были удалены, а операционные таксономические единицы (OTU) были назначены с использованием кластеризации на основе расстояния VSEARCH с порогом сходства 97%. Индексы альфа- и бета-разнообразия были созданы с использованием веганского пакета в R40. Матрица данных на основе OTU была построена для участников, включенных в фенотип ppTG.

Метаболомный анализ. Замороженные образцы сыворотки оттаивали и помещали 20 мкл в чистую пробирку. К образцу добавляли 80 мкл метанола класса ВЭЖХ, после чего его ненадолго встряхивали и помещали в морозильную камеру при -80°C на 2 часа. Через два часа образец центрифугировали при 20 000g в течение 10 минут. Супернатант метаболита собирали и концентрировали в Speed ​​Vac досуха, в то время как белковый осадок отбрасывали. Затем образцы хранили при -80°С до готовности к анализу ЖХ-МС, после чего их восстанавливали 40 мкл смеси метанол:вода (50:50) и помещали в чистую пробирку для масс-спектрометрии. Анализ был выполнен на МС Q-TOF Agilent 6538, соединенном с УВЭЖХ Agilent 1290 с использованием колонки 130A, 1,7 мкм, 2,1 мм X 10 мм Acquity BEH-HILIC HPLC. Образцы были ионизированы с помощью ионизации электрораспылением, и циклы были завершены в положительном режиме. Подвижная фаза A представляла собой формиат аммония с концентрацией 15 ммоль/л, а подвижная фаза B представляла собой ACN с использованием градиента A 10-40% в течение 6 минут. Скорость потока поддерживали на уровне 400 мкл/мин, а температуру в отделении колонки устанавливали на уровне 30°С. Анализ МС-МС проводили с использованием тех же условий ЖХ, но с целью определения конкретных ионов с использованием времени удерживания и значений m/z из предыдущих запусков МС. После завершения анализа LCMS файлы необработанных данных были преобразованы в .xml. файлы с помощью MSConvert. Затем данные обрабатывались с помощью mzMine с минимальным значением интенсивности 1000 на основе визуальной проверки общей ионной хроматограммы для устранения шума. Пустые образцы также анализировали, и полученные признаки удаляли из биологических данных, если они присутствовали в соотношении менее 5:1 в образце по сравнению с пустым. Затем добытые данные вводились в MetaboAnalyst для статистического анализа. Данные тандемной МС были проанализированы с помощью программного обеспечения Sirius для выявления особенностей.