Dopady arónie na zánět a střevní mikrobiom

Antropometrie. Měření byla shromážděna od účastníků pomocí validované segmentální multifrekvenční bioelektrické impedanční analýzy (SECA mBCA 515, Hamburg, Německo). Pro analýzu byla použita hmotnost tuku (%) a odhadovaná viscerální adipóza (L).

Výzva s vysokým obsahem tuku. Jídlo s vysokým obsahem tuku obsahovalo slané máslo (58,3 g, Tillamook) přes 3 kusy celozrnného toastu (127,5 g; Wheat Montana). Celkový energetický obsah jídla byl 714 kcal, z toho 43,1 % z tuku, s štěpením makroživin 50 g tuku, 54 g sacharidů a 12 g bílkovin. K jídlu byla poskytnuta voda; místo toho byl účastníkům, kteří byli označeni za obvyklé konzumenty kávy, poskytnut kofeinový černý čaj.

Odběr krve. Účastníci byli instruováni, aby se 24 hodin před návštěvou vyvarovali konzumace alkoholu a namáhavé fyzické aktivity a aby před odběrem krve dokončili noční půst (10 - 12 hodin). Vzorky krve účastníků byly odebírány certifikovanou sestrou nebo lékařem ráno před požitím jídla a každou hodinu po dobu 4 hodin po požití jídla, celkem pět časových bodů. Plná krev ve zkumavkách pro separaci séra se nechala srážet po dobu 15 minut před centrifugací při 1200 ot./min po dobu 15 minut, přičemž výsledné sérum bylo rozděleno na alikvoty a skladováno při -80 °C až do analýzy.

Stanovení krevních markerů. Krevní markery metabolického syndromu byly stanoveny z celé krve na lipidových panelech Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, USA). Sérový inzulín (INS) byl stanoven pomocí soupravy insulin ELISA (MP Biomedicals, Solon, OH) provedené podle pokynů výrobce. Měření cytokinů bylo prováděno za použití vysoce citlivé multiplexní technologie (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) podle postupů od Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA). Byly měřeny klasické systémové prozánětlivé cytokiny a zahrnují faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), interleukin (IL)-1B, IL-6, tumor nekrotizující faktor (TNF)-a. Byly také měřeny interleukinI-17 a IL-23, které oba plní prozánětlivou a regulační roli ve střevní sliznici. Vzorky séra v každém časovém bodě během čelenže s jídlem s vysokým obsahem tuku byly testovány v duplikátech.

Kolekce vzorků stolice. Byly poskytnuty odběrové soupravy a účastníci byli požádáni, aby dodržovali uvedené pokyny pro vlastní odběr vzorku stolice 24 hodin před návštěvou odběru krve. Po počátečním odběru do sterilní jednorázové komody byla malá část vzorku přenesena do sterilní Eppendorfovy zkumavky a dopravena k výzkumníkům. Vzorky byly připraveny a rozděleny na alikvoty v anaerobní komoře a poté zmrazeny při -80 °C až do analýzy.

Extrakce genomové DNA a mikrobiální analýza. Extrakce objemové DNA z fekálních vzorků byla provedena pomocí Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) a natloukání kuliček. DNA byla přes noc odeslána na University of Michigan, Michigan Microbiome Project pro sekvenování amplikonu Illumina MiSeq oblasti 16S rRNA V4. Po kvantifikaci DNA byly vytvořeny knihovny amplikonů V4 s primery s čárovým kódem s duálním indexem, poté purifikací knihovny, spojením a sekvenováním s párovým koncem MiSeq. Čtení nezpracovaného sekvenování byly zpracovány a upraveny pomocí softwaru MOTHUR (verze 1.35.1) podle standardního provozního postupu MOTHUR pro platformu MiSeq39. Ve stručném přehledu byly čtení na párovém konci sestaveny do souvislých sekvencí a testovány na délku a kvalitu. Zbývající kontigy byly porovnány s databází SILVA ribozomální RNA (vydání 132), komplexní sbírkou porovnaných sekvencí rRNA. Potenciálně chimérické sekvence byly identifikovány a odstraněny pomocí algoritmu UCHIME v MOTHUR. Taxonomické klasifikace byly přiřazeny pomocí Bayesovského klasifikátoru projektu Ribosomal Database Project. Necílová čtení byla odstraněna a operační taxonomické jednotky (OTU) byly přiřazeny pomocí shlukování na základě vzdálenosti VSEARCH na prahu 97% podobnosti. Indexy diverzity alfa a β byly generovány pomocí veganského balíčku v R40. Pro účastníky zahrnuté ve fenotypu ppTG byla vytvořena datová matice založená na OTU.

Metabolomická analýza. Zmrazené vzorky séra byly rozmraženy a 20 μl bylo umístěno do čisté zkumavky. Ke vzorku bylo přidáno 80 ul methanolu čistoty pro HPLC, poté byl vzorek krátce promíchán a umístěn na 2 hodiny do mrazáku -80 °C. Po dvou hodinách byl vzorek centrifugován při 20 000 g po dobu 10 minut. Metabolitový supernatant byl shromážděn a zakoncentrován ve Speed ​​Vac do sucha, zatímco proteinová peleta byla odstraněna. Vzorky byly poté skladovány při -80 °C, dokud nebyly připraveny pro LCMS analýzu, kdy byly rekonstituovány 40 ul směsi methanol:voda (50:50) a umístěny do čisté nádobky pro hmotnostní spektrometrii. Analýza byla dokončena na Agilent 6538 Q-TOF MS spojeném s Agilent 1290 UHPLC s použitím 130A, 1,7 um, 2,1 mm X 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC kolony. Vzorky byly ionizovány pomocí elektrosprejové ionizace a běhy byly dokončeny v pozitivním režimu. Mobilní fáze A byla 15 mmol/l mravenčan amonný a mobilní fáze B byla ACN s použitím 10-40% A gradientu během 6 minut. Průtok byl udržován na 400 ul/minutu a teplota komory kolony byla nastavena na 30 °C. Analýza MSMS byla dokončena za použití stejných podmínek LC při cílení specifických iontů pomocí retenčního času a hodnot m/z z předchozích běhů MS. Po dokončení analýzy LCMS byly soubory nezpracovaných dat převedeny na .xml soubory pomocí MSConvert. Data byla poté vytěžena pomocí mzMine s použitím minimální hodnoty intenzity 1 000 na základě vizuální kontroly celkového iontového chromatogramu pro odstranění šumu. Byly také zpracovány slepé vzorky a výsledné znaky byly odstraněny z biologických dat, pokud byly přítomny ve vzorku v poměru pod 5:1 ve srovnání se slepým pokusem. Vytěžená data byla poté vložena do MetaboAnalystu pro statistickou analýzu. Tandemová MS data byla analyzována pomocí softwaru Sirius pro identifikaci funkcí.