아로니아가 염증과 장내 마이크로바이옴에 미치는 영향

인체 측정학. 검증된 분절 다중 주파수 생체 전기 임피던스 분석(SECA mBCA 515, 독일 함부르크)을 사용하여 참가자로부터 측정값을 수집했습니다. 체지방량(%)과 추정 내장지방(L)을 분석에 사용하였다.

고지방식이 챌린지. 고지방 식사에는 통밀 토스트(127.5g, Wheat Montana) 3조각 위에 소금에 절인 버터(58.3g, Tillamook)가 포함되어 있습니다. 식사의 총 에너지 함량은 714kcal이었고 지방은 43.1%였으며 다량 영양소는 지방 50g, 탄수화물 54g, 단백질 12g으로 분해되었습니다. 식사와 함께 물이 제공되었습니다. 습관적인 커피 소비자로 확인된 참가자에게는 대신 카페인이 함유된 홍차가 제공되었습니다.

혈액 샘플링. 참가자들은 방문 전 24시간 동안 알코올 섭취와 격렬한 신체 활동을 피하고 채혈하기 전에 하룻밤 금식(10~12시간)을 완료하도록 지시받았습니다. 참가자의 혈액 샘플은 식사 섭취 전 아침과 식사 섭취 후 4시간 동안 매시간 총 5개의 시점에서 인증된 간호사 또는 의사에 의해 수집되었습니다. 혈청 분리 튜브의 전혈은 15분 동안 1200 RPM에서 원심분리하기 전에 15분 동안 응고되도록 두었고 결과 혈청은 분주되어 분석 전까지 -80ºC에서 보관되었습니다.

혈액 마커의 결정. 대사 증후군의 혈액 마커는 Picollo Xpress Chemistry Analyzer 지질 패널(Abaxis, Union City, USA)에서 실행된 전혈로부터 결정되었습니다. 제조사 지침에 따라 수행된 인슐린 ELISA 키트(MP Biomedicals, Solon, OH)를 사용하여 혈청 인슐린(INS)을 측정하였다. Cytokine 측정은 Millipore(EMD Millipore Corporation, Billerica, USA)의 절차에 따라 고감도 다중화 기술(Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS)을 사용하여 수행되었습니다. 고전적인 전신 전염증성 사이토카인을 측정했으며 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨(IL)-1B, IL-6, 종양 괴사 인자(TNF)-α를 포함합니다. 장 점막에서 전 염증 및 조절 역할을 하는 인터루킨 I-17 및 IL-23도 측정되었습니다. 고지방 식사 챌린지 동안 각 시점의 혈청 샘플을 이중으로 실행했습니다.

대변 ​​샘플 수집. 수집 키트가 제공되었고 참가자들은 혈액 수집 방문 24시간 전에 대변 샘플 자가 수집을 위해 포함된 지침을 따르도록 요청받았습니다. 멸균된 일회용 변기에 처음 수집한 후 샘플의 작은 부분을 멸균된 Eppendorf 튜브로 옮겨 연구자에게 전달했습니다. 샘플을 준비하고 혐기성 챔버에서 분주한 다음 분석할 때까지 -80ºC에서 동결했습니다.

게놈 DNA 추출 및 미생물 분석. Powersoil DNA Isolation Kit(Mo Bio Laboratories, Inc.) 및 비드 비팅을 사용하여 배설물 샘플에서 벌크 DNA를 추출했습니다. DNA는 16S rRNA V4 영역의 Illumina MiSeq 앰플리콘 시퀀싱을 위해 미시간 대학, 미시간 마이크로바이옴 프로젝트로 밤새 배송되었습니다. DNA 정량화 후 V4 amplicon 라이브러리는 이중 인덱스 바코드 프라이머로 생성된 다음 라이브러리 정제, 풀링 및 MiSeq 페어드 엔드 시퀀싱을 통해 생성되었습니다. 원시 시퀀싱 읽기는 MOTHUR 소프트웨어(버전 1.35.1)를 사용하여 처리 및 선별되었습니다. MiSeq 플랫폼39에 대한 MOTHUR 표준 작동 절차를 따릅니다. 간략한 검토에서 페어드 엔드 판독을 연속적인 시퀀스로 조립하고 길이와 품질에 대해 스크리닝했습니다. 나머지 콘티그는 정렬된 rRNA 서열의 포괄적인 컬렉션인 SILVA 리보솜 RNA 데이터베이스(릴리스 132)에 정렬되었습니다. MOTHUR에서 UCHIME 알고리즘을 사용하여 잠재적으로 키메라 서열을 식별하고 제거했습니다. 분류학적 분류는 Ribosomal Database Project의 베이지안 분류기를 사용하여 할당되었습니다. 비표적 읽기가 제거되었고 97% 유사성 임계값에서 VSEARCH 거리 기반 클러스터링을 사용하여 운영 분류 단위(OTU)가 할당되었습니다. 알파 및 베타 다양성 지수는 R40의 비건 패키지를 사용하여 생성되었습니다. OTU 기반 데이터 매트릭스는 ppTG 표현형에 포함된 참가자를 위해 구성되었습니다.

대사체 분석. 냉동 혈청 샘플을 해동하고 20μL를 깨끗한 튜브에 넣었습니다. 80μL의 HPLC 등급 메탄올을 샘플에 첨가한 후 잠시 와동시키고 -80C 냉동고에 2시간 동안 두었습니다. 2시간 후, 샘플을 20,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 대사산물 상청액을 수집하고 Speed ​​Vac에서 농축하여 건조시켰으며 단백질 펠릿은 폐기했습니다. 샘플은 40μL의 메탄올:물(50:50)로 재구성된 LCMS 분석을 위해 준비될 때까지 -80C에서 보관되었고 깨끗한 질량 분석 바이알에 배치되었습니다. 130A, 1.7μm, 2.1mm X 10mm Acquity BEH-HILIC HPLC 컬럼을 사용하여 Agilent 1290 UHPLC에 연결된 Agilent 6538 Q-TOF MS에서 분석을 완료했습니다. 샘플은 전기분무 이온화를 통해 이온화되었고 실행은 양성 모드에서 완료되었습니다. 이동상 A는 15mmol/L 포름산암모늄이었고 이동상 B는 6분에 걸쳐 10-40% A 구배를 사용하는 ACN이었습니다. 흐름은 400µL/분으로 유지되었고 컬럼 구획 온도는 30C로 설정되었습니다. MSMS 분석은 동일한 LC 조건을 사용하여 완료되었으며 이전 MS 실행의 보유 시간 및 m/z 값을 사용하여 특정 이온을 표적으로 삼았습니다. LCMS 분석 완료 후 원시 데이터 파일을 .xml로 변환 MSConvert를 사용하는 파일. 그런 다음 노이즈를 제거하기 위해 총 이온 크로마토그램의 육안 검사를 기반으로 강도 최소값 1,000을 사용하여 mzMine으로 데이터를 마이닝했습니다. 블랭크 샘플도 실행하고 블랭크와 비교하여 샘플에서 5:1 미만의 비율로 존재하는 경우 결과 특징을 생물학적 데이터에서 제거했습니다. 마이닝된 데이터는 통계 분석을 위해 MetaboAnalyst에 입력되었습니다. Tandem MS 데이터는 기능을 식별하기 위해 Sirius 소프트웨어로 분석되었습니다.