Wpływ aronii na stany zapalne i mikrobiom jelitowy

Antropometria. Pomiary zostały zebrane od uczestników przy użyciu zwalidowanej segmentowej wieloczęstotliwościowej analizy impedancji bioelektrycznej (SECA mBCA 515, Hamburg, Niemcy). Do analizy wykorzystano masę tłuszczu (%) i oszacowaną ilość tkanki tłuszczowej trzewnej (L).

Wyzwanie związane z posiłkiem o wysokiej zawartości tłuszczu. Posiłek o wysokiej zawartości tłuszczu zawierał solone masło (58,3 g, Tillamook) na 3 kawałkach tostów pełnoziarnistych (127,5 g; Wheat Montana). Całkowita wartość energetyczna posiłku wynosiła 714 kcal, z czego 43,1% pochodziło z tłuszczu, przy rozkładzie makroskładników na 50 g tłuszczu, 54 g węglowodanów i 12 g białka. Do posiłku dostarczano wodę; zamiast tego podano czarną herbatę z kofeiną uczestnikom, którzy identyfikowali się jako nałogowi konsumenci kawy.

Pobieranie próbek krwi. Uczestników poinstruowano, aby unikali spożywania alkoholu i forsownej aktywności fizycznej na 24 godziny przed wizytą oraz by przed pobraniem krwi odbyli nocną głodówkę (10-12 godzin). Próbki krwi uczestników były pobierane przez certyfikowaną pielęgniarkę lub lekarza rano przed spożyciem posiłku i co godzinę przez 4 godziny po spożyciu posiłku, w sumie pięć punktów czasowych. Pełną krew w probówkach do rozdzielania surowicy pozostawiono do skrzepnięcia na 15 minut przed wirowaniem przy 1200 obr./min przez 15 minut, po czym uzyskaną surowicę podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Oznaczanie markerów krwi. Markery krwi zespołu metabolicznego określono z krwi pełnej na panelach lipidowych Picollo Xpress Chemistry Analyzer (Abaxis, Union City, USA). Insulina w surowicy (INS) została określona przy użyciu zestawu insuliny ELISA (MP Biomedicals, Solon, OH) wykonanego zgodnie z instrukcjami producenta. Pomiar cytokin przeprowadzono przy użyciu technologii multipleksowania o wysokiej czułości (Bio-Rad Bio-Plex 200 HTS) zgodnie z procedurami firmy Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, USA). Mierzono klasyczne ogólnoustrojowe cytokiny prozapalne, które obejmowały czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interleukinę (IL)-1B, IL-6, czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α. Mierzono również interleukinę I-17 i IL-23, które pełnią rolę prozapalną i regulacyjną w błonie śluzowej jelita. Próbki surowicy w każdym punkcie czasowym podczas prowokacji posiłkiem wysokotłuszczowym analizowano w dwóch powtórzeniach.

Pobieranie próbek kału. Dostarczono zestawy do pobierania i poproszono uczestników o przestrzeganie dołączonych instrukcji dotyczących samodzielnego pobrania próbki kału w ciągu 24 godzin przed wizytą pobrania krwi. Po początkowym pobraniu do sterylnej jednorazowej komody, niewielką część próbki przeniesiono do sterylnej probówki Eppendorfa i przetransportowano do badaczy. Próbki przygotowano i podzielono na porcje w komorze beztlenowej, a następnie zamrożono w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Ekstrakcja genomowego DNA i analiza drobnoustrojów. Ekstrakcję masowego DNA z próbek kału przeprowadzono przy użyciu zestawu Powersoil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) i ubijania kulkami. DNA zostało wysłane przez noc do University of Michigan, Michigan Microbiome Project w celu sekwencjonowania amplikonu Illumina MiSeq regionu 16S rRNA V4. Po ilościowym oznaczeniu DNA, biblioteki amplikonów V4 zostały wygenerowane za pomocą starterów z kodem kreskowym o podwójnym indeksie, a następnie przez oczyszczenie biblioteki, połączenie i sekwencjonowanie sparowanych końców MiSeq. Surowe odczyty sekwencjonowania zostały przetworzone i sprawdzone przy użyciu oprogramowania MOTHUR (wersja 1.35.1) zgodnie ze standardową procedurą operacyjną MOTHUR dla platformy MiSeq39. W krótkim przeglądzie odczyty ze sparowanymi końcami zostały połączone w ciągłe sekwencje i sprawdzone pod kątem długości i jakości. Pozostałe kontigi dopasowano do bazy danych rybosomalnego RNA SILVA (wydanie 132), obszernego zbioru dopasowanych sekwencji rRNA. Potencjalnie chimeryczne sekwencje zostały zidentyfikowane i usunięte przy użyciu algorytmu UCHIME w MOTHUR. Klasyfikacje taksonomiczne zostały przypisane przy użyciu klasyfikatora bayesowskiego projektu rybosomalnej bazy danych. Odczyty niedocelowe zostały usunięte, a operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) zostały przypisane przy użyciu grupowania opartego na odległości VSEARCH na progu podobieństwa 97%. Wskaźniki różnorodności alfa i β zostały wygenerowane przy użyciu pakietu wegańskiego w R40. Skonstruowano macierz danych opartą na OTU dla uczestników objętych fenotypem ppTG.

Analiza metaboliczna. Zamrożone próbki surowicy rozmrożono i 20 μl umieszczono w czystej probówce. Do próbki dodano 80 μl metanolu czystości HPLC, po czym krótko worteksowano i umieszczono w zamrażarce -80°C na 2 godziny. Po dwóch godzinach próbkę wirowano przy 20 000 g przez 10 minut. Supernatant metabolitu zebrano i zatężono w Speed ​​Vac do sucha, podczas gdy peletkę białka odrzucono. Następnie próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy LCMS, po czym rozpuszczono je w 40 μl mieszaniny metanol:woda (50:50) i umieszczono w czystej fiolce do spektrometrii mas. Analizę zakończono na Agilent 6538 Q-TOF MS sprzężonym z Agilent 1290 UHPLC przy użyciu kolumny 130A, 1,7 μm, 2,1 mm X 10 mm Acquity BEH-HILIC HPLC. Próbki jonizowano za pomocą jonizacji przez elektrorozpylanie, a przebiegi zakończono w trybie dodatnim. Fazę ruchomą A stanowił mrówczan amonu o stężeniu 15 mmol/l, a fazę ruchomą B stanowił ACN, stosując gradient 10-40% A przez 6 minut. Przepływ utrzymywano na poziomie 400 µl/minutę, a temperaturę przedziału kolumny ustawiono na 30°C. Analizę MSMS zakończono stosując te same warunki LC, kierując na określone jony stosując czas retencji i wartości m/z z poprzednich przebiegów MS. Po zakończeniu analizy LCMS pliki surowych danych zostały przekonwertowane do formatu .xml pliki za pomocą programu MSConvert. Dane zostały następnie wydobyte za pomocą mzMine przy minimalnej wartości intensywności 1000 w oparciu o kontrolę wzrokową całkowitego chromatogramu jonowego w celu usunięcia szumu. Przeprowadzono również ślepe próbki i uzyskane cechy usunięto z danych biologicznych, jeśli były obecne w stosunku poniżej 5:1 w próbce w porównaniu z ślepą próbą. Wydobyte dane zostały następnie wprowadzone do MetaboAnalyst w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Dane Tandem MS zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania Sirius w celu zidentyfikowania cech.