コンゴ民主共和国におけるエボラウイルス病のモバイル ポイント オブ ケア診断テスト (MobEboDRC)

ギニアでのエボラ出血熱の流行では、患者の最大 90% が陰性と診断されましたが、鑑別診断はめったに行われず、マラリアやその他の病気の診断が下されたため、これらの感染性病原体によるより多くの死亡につながる可能性が最も高くなりました。 もう 1 つの重要な側面は、患者が他の病気に苦しんでいる間にエボラに感染するのではないかという恐怖を、病原体の種類の正確な診断をタイムリーに提供することによって克服しなければならないということです。 [ダンバーNKら]。

RPA アッセイは、従来のリアルタイム PCR よりも 6 倍速く、分析感度と特異性は同じです。 さらに、RPA 形式 (機器サイズ、コールド チェーンに依存しない試薬) により、迅速なオンサイト テストが実現可能で手頃な価格になります。 硬質プラスチック製のグローブボックス、診断用スーツケース (DiaS)、およびソーラー パネルと電源パックのセットで構成されるモバイル ラボを開発しました。 分解されたグローブ ボックスは、他の必要な材料 (消毒液、抽出キット、フィルター チップ、ラック、ボルテックス、ヒート ブロック、オートクレーブ可能なビニール袋、個人用保護具 (PPE) と一緒に金属製の箱 (80 × 60 × 41 cm) に保管されます)。 総重量は箱が28kg、DiaSが16kg。 これまでの SE キットを使用したサンプルの不活性化と RNA 抽出は、グローブ ボックス内で行われていました。 これにより、ハザードグループ 4 のサンプルの取り扱いが可能になりました。 RT-RPA アッセイは、タッチスクリーンが統合された ESEQuant TS2 デバイスを含む DiaS で実行され、ラップトップを必要とせずにデバイスを操作し、結果を表示するため、消毒が容易ではありません (図 1)。モバイルラボは正常に展開されました。コナクリでは、2014 年末にかけて、主に埋葬中の非報告、寡黙、および感染伝播の連鎖が原因で、症例数が増加しました。 安全で尊厳のある埋葬（SDB）プログラムの結果を迅速に提供するために、マトト・グベッシア港 II 地区に 2 つの移動式実験室が設置されました。 全部で 928 の死後綿棒サンプルがテストされました。 全体で、120 サンプル (12.9%) が陽性と評価されました。 肯定的な結果が 30 ～ 40 分以内に得られ、SDB チームに直接報告されました [Faye O et al.]。

アプローチ

目的：

ディファレンシャル RPA の性能と動作特性を評価するために、i) ギニアと DRC で収集されたサンプルからの十分に特徴付けられた EBOV 血清のパネル、ii) EVD の疑いのある症例からの血清、および iii) IPD と NIBR での定期的な診断からの血清を使用します。

調査対象母集団：

この研究は、EVDの疑いのある人、アーカイブされたEBOV陰性サンプル、および選択された定期的な診断サンプルからの資料で実施されます。

包含および除外基準: DRC で現在使用されている症例定義に従って、リアルタイム RT-PCR アッセイに適格な「疑わしい」および「可能性の高い」EVD 症例の WHO 症例定義を満たすすべての被験者 (男性、女性、成人、および子供)。 前向き評価では、患者/法定後見人からの口頭でのインフォームドコンセントが必要であり、研究に参加する資格があり、除外基準は、被験者の安全を危険にさらす可能性のある同意、サンプル、または状態を提供できないことです。

サンプルサイズ：

各異なる病原体の 50 ～ 100 の RT-PCR 陽性サンプルと 50 ～ 100 の RT-PCR 陰性サンプルのパネルを組み立てて使用します。 RPA アッセイの感度と特異度が 98% (信頼区間 95%) であると予想される場合、各パラメーターについて少なくとも 30 の陽性および陰性のケースを研究に含める必要があります。 ギニアでの経験に基づくと、疑わしい症例からのサンプルに対するRT-PCR検査の10%がEBOV陽性です。 したがって、少なくとも 30 の EVD 陽性サンプルを取得するには、300 の EVD 疑い症例をスクリーニングする必要があります。 残りの 270 サンプルでは、​​P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV の有病率勾配が予想されます。 各パラメーターについてテストされる陽性と陰性の最小数は、それらの有病率に従って計算されます。

サンプルの収集と処理:

熱性患者および潜在的な新しいエボラウイルス病のアウトブレイクを対象とした前向き研究では、プロトコルに含まれるエボラウイルス病の症状のある患者に対してコンゴ民主共和国で使用されている SOP と調和したギニアでのエボラウイルス病のアウトブレイクで実施された SOP に従って、唾液と血清を口腔スワブと静脈穿刺によって収集します。基準。 EBOV-RPA およびリアルタイム RT-PCR が実行され、結果は一致する陰性または陽性または不一致に分類されます。 EBOV陰性および陽性の結果が得られた患者は、現地で確立された基準に従って、それぞれ退院または入院します。 不一致の結果は、同じサンプルと 24 時間後に収集された補足サンプルで再テストされます。 不一致が解決できない場合は、結果について臨床医と話し合い、状況に応じて患者と地域社会にとって最善の決定を下します。 アーカイブされたサンプルは、冷凍庫に保存されたアリコートから直接テストされます。

サンプル抽出プロトコル:

最初に収集されたすべてのサンプルは、BSL-3 ポータブル グローブ ボックス (図 2) で換散バッファーを使用して不活性化の手順に従います。 2 つの迅速な抽出プロトコルを検証し、現場での使用への適合性を比較します。(i) TwistDX が提供する NaoH ベースのアルカリ溶解プロトコルは、全血および血清に直接使用できます [Osmundson TW et al.]、(ii) a粗サンプルからの全核酸抽出を可能にする濾紙ベースの核酸抽出法[Zou Y et al.]。

どちらのプロトコルも最大 10 分かかります。 抽出物は、カナダのウィニペグ (NML) にある BSL-4 研究所に送られ、細胞培養への接種によるサンプル抽出物中のエボラウイルスの不活化が確認されます。 RPA は、必要なすべての機器と試薬を含むスーツケース ラボから操作されます (図 1)。

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データの収集と保存:

臨床データと結果は、ギニアで使用されている既存のアンケートを介して記録され、コンゴ民主共和国の手順に合わせてデータベースに入力されます。 データには、年齢、性別、入院日、発症日、サンプリング日、詳細な症状、検査結果、患者の最終分類、疾患転帰が含まれますが、これらに限定されません。

適切な品質管理手段を実施して、データ収集のプロセスの信頼性、エントリー全般の管理コンプライアンス、および生成されたデータの品質を監視します。 研究の最後に、収集されたすべてのデータは品質管理され、データ分析のためにロックされます。

標準業務手順書：

該当するすべての研究プロセスの SOP が利用可能になります。

データ分析方法:

臨床データを分析して、研究集団の正確な説明を提供します。 収集された各変数は、量的変数の平均、中央値、標準偏差、および質的変数の度数などの統計指標を使用して記述されます。 EVD 診断テストの分析性能と臨床性能を比較するために、95% 信頼区間と有意性テスト (Xi 2 乗など) が提供されます。

テスト精度:

陽性基準 陰性基準 検査結果 検査結果 陽性検査結果 TP FP

陰性の検査結果 FN TN

感度: 真陽性サンプルの割合。 (TP/TP+FN) 特異性: 真陰性サンプルの割合。 (TN/TN+FP) 感度と特異度をカッパ値に組み合わせて、テストの全体的なパフォーマンスを推定します。

テストの有用性:

ユーザーの使いやすさを評価するためのスコアリング システムが開発されます。