Mobile Point of Care Test diagnostici per la malattia da virus Ebola nella Repubblica Democratica del Congo (MobEboDRC)

Nell'epidemia di Ebola in Guinea, fino al 90% dei pazienti è risultato negativo ma raramente sono stati diagnosticati differenziali e la malaria e altre malattie sono state sottodiagnosticate, il che molto probabilmente ha portato a più decessi a causa di questi agenti infettivi. Un altro aspetto importante è che, la paura dei pazienti di avere l'Ebola, mentre sono affetti da altre malattie, deve essere superata fornendo tempestivamente la corretta diagnosi del tipo di patogeno. [Dunbar NK et al.].

Il test RPA è sei volte più veloce della PCR in tempo reale convenzionale, pur offrendo la stessa sensibilità e specificità analitiche. Inoltre, il formato RPA (dimensioni dell'apparecchiatura, reagenti indipendenti dalla catena del freddo) rende fattibili e convenienti test rapidi in loco. Abbiamo sviluppato un laboratorio mobile, che consiste in un vano portaoggetti in plastica rigida, un Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS) e un pannello solare e un set di alimentatori. Il glovebox smontato è conservato in una scatola metallica (80 × 60 × 41 cm) con altri materiali necessari (soluzione disinfettante, kit di estrazione, puntali con filtro, rack, vortex, blocco termico, buste di plastica autoclavabili e dispositivi di protezione individuale (DPI). Il peso totale è di 28 kg per la scatola e 16 kg per il DiaS. L'inattivazione del campione e l'estrazione dell'RNA utilizzando il kit SE finora sono state eseguite nel cassetto portaoggetti. Ciò ha consentito la manipolazione dei campioni del gruppo di rischio 4. Il test RT-RPA è stato eseguito nel DiaS contenente il dispositivo ESEQuant TS2 con touchscreen integrato per utilizzare il dispositivo e visualizzare i risultati senza la necessità di un laptop, che non è facile da disinfettare (Figura 1). Il laboratorio mobile è stato implementato con successo a Conakry, quando verso la fine del 2014 si è sviluppato un numero crescente di casi, dovuto principalmente alla mancata denuncia, alla reticenza e alle catene di trasmissione dell'infezione durante i seppellimenti. Per fornire risultati rapidi per il programma di sepoltura sicura e dignitosa (SDB), sono stati allestiti due laboratori mobili nel distretto di Matoto Gbessia Port II. Complessivamente sono stati testati 928 campioni di tampone post mortem. Complessivamente, 120 campioni (12,9%) sono risultati positivi. I risultati positivi sono stati ottenuti entro 30-40 minuti e riportati direttamente alle équipe SDB [Faye O et al.].

APPROCCIO

Obbiettivo:

Per valutare le prestazioni e le caratteristiche operative dell'RPA differenziale utilizzeremo i) un pannello di sieri EBOV ben caratterizzati da campioni raccolti in Guinea e RDC ii) sieri da casi sospetti di EVD e iii) sieri dalla diagnostica di routine presso IPD e NIBR.

Popolazione studiata:

Lo studio sarà condotto su materiale proveniente da persone sospette di EVD, campioni negativi per EBOV archiviati e potenziali e campioni diagnostici di routine selezionati.

Criteri di inclusione ed esclusione: tutti i soggetti (maschi, femmine, adulti e bambini) che soddisfano la definizione di caso dell'OMS di caso di EVD "sospetto" e "probabile" ammissibili per il test RT-PCR in tempo reale, secondo la definizione di caso attualmente utilizzata nella Repubblica Democratica del Congo. Per la valutazione prospettica, sarà richiesto il consenso informato orale del paziente/tutore legale per l'idoneità a partecipare allo studio e i criteri di esclusione saranno l'impossibilità di fornire il consenso, campioni o condizioni che potrebbero mettere a repentaglio la sicurezza del soggetto.

Misura di prova:

Verrà assemblato e utilizzato un pannello di 50-100 campioni positivi per RT-PCR per ciascun patogeno differenziale e 50-100 campioni negativi per RT-PCR. Con una sensibilità e una specificità del test RPA previste del 98% (intervallo di confidenza del 95%), nello studio devono essere inclusi un minimo di 30 casi positivi e negativi per ciascun parametro. Sulla base della nostra esperienza in Guinea, il 10% dei test RT-PCR su campioni di casi sospetti è positivo per EBOV. Di conseguenza, 300 casi sospetti di EVD devono essere sottoposti a screening per ottenere almeno 30 campioni positivi per EVD. Nei restanti 270 campioni ci si aspetterebbe un gradiente di prevalenza di P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV. Il numero minimo di positivi e negativi da testare per ciascun parametro sarà calcolato in base alla loro prevalenza.

Raccolta ed elaborazione dei campioni:

Per lo studio prospettico su pazienti febbrili e potenziali nuovi focolai di EVD, la saliva e il siero saranno raccolti tramite tampone orale e prelievo venoso secondo la SOP eseguita nell'epidemia di EVD in Guinea armonizzata con le SOP utilizzate nella Repubblica Democratica del Congo per i pazienti con sintomi EVD conformi all'inclusione del protocollo criteri. Verranno eseguite EBOV-RPA e real time RT-PCR ei risultati saranno classificati come concordanti negativi o positivi o discordanti. I pazienti con esito EBOV negativo e positivo saranno rispettivamente dimessi o ricoverati secondo criteri stabiliti localmente. I risultati discordanti verranno testati nuovamente sullo stesso campione e su uno supplementare raccolto 24 ore dopo. Se la discrepanza non può essere risolta, i risultati saranno discussi con il medico per prendere la decisione migliore per il paziente e le comunità in merito al contesto. I campioni archiviati saranno testati direttamente da aliquote conservate nel congelatore.

Protocollo di estrazione del campione:

Inizialmente tutti i campioni raccolti saranno sottoposti alla fase di inattivazione utilizzando il tampone di lisi nel Glove box portatile BSL-3 (Figura 2). Due protocolli di estrazione rapida saranno convalidati e confrontati per la loro idoneità all'uso sul campo, (i) un protocollo di lisi alcalina basato su NaoH fornito da TwistDX che può essere utilizzato direttamente su sangue intero e siero [Osmundson TW et al.], (ii) un Metodo di estrazione dell'acido nucleico basato su carta da filtro che consente l'estrazione totale dell'acido nucleico da campioni grezzi [Zou Y et al.].

Entrambi i protocolli richiedono un massimo di 10 minuti. Gli estratti saranno inviati al laboratorio BSL-4 di Winnipeg, Canada (NML), per confermare l'inattivazione del virus Ebola nell'estratto del campione mediante inoculazione su coltura cellulare. L'RPA sarà gestito dal laboratorio della valigia, che contiene tutte le attrezzature e i reagenti necessari (Figura 1)

.

Raccolta e conservazione dei dati:

I dati clinici ei risultati saranno registrati tramite un questionario esistente utilizzato in Guinea, armonizzato alle procedure nella RDC e inserito in un database. I dati includono ma non sono limitati a età, sesso, data di ricovero, data di insorgenza, data di campionamento, sintomi dettagliati, risultati dei test, classificazione finale del paziente, esito della malattia.

Saranno implementate adeguate misure di controllo della qualità per monitorare l'affidabilità del processo per la raccolta dei dati, la conformità della gestione generale dell'ingresso e per la qualità dei dati generati. Alla fine dello studio tutti i dati raccolti saranno controllati per la qualità e bloccati per l'analisi dei dati.

Procedura operativa normale:

Saranno rese disponibili le SOP di tutti i processi di ricerca applicabili.

Metodi di analisi dei dati:

I dati clinici saranno analizzati per fornire una descrizione accurata della popolazione in studio. Ogni variabile raccolta sarà descritta utilizzando indicatori statistici quali media, mediana, deviazione standard per le variabili quantitative e frequenze per le variabili qualitative. Verranno forniti gli intervalli di confidenza al 95% e test di significatività (come Xi-quadrato) per il confronto tra le prestazioni analitiche e cliniche dei test diagnostici EVD.

Precisione del test:

Rif positivo Rif negativo Risultato test Risultato test Risultato test positivo TP FP

Risultato negativo del test FN TN

Sensibilità: percentuale di campioni veri positivi. (TP/TP+FN) Specificità: percentuale di campioni veri negativi. (TN/TN+FP) La sensibilità e la specificità saranno combinate in un valore kappa per stimare le prestazioni complessive dei test.

Utilità di prova:

Sarà sviluppato un sistema di punteggio per valutare la facilità d'uso