Diagnostische tests voor mobiele point-of-care voor ebolavirusziekte in de DRC (MobEboDRC)

Bij de ebola-uitbraak in Guinee testte tot 90% van de patiënten negatief, maar werden zelden gediagnosticeerd voor verschillen en malaria en andere ziekten werden ondergediagnosticeerd, wat hoogstwaarschijnlijk leidde tot meer sterfgevallen door deze infectieuze agentia. Een ander belangrijk aspect is dat de angst van de patiënten om ebola te hebben, terwijl ze aan een andere ziekte lijden, moet worden overwonnen door tijdig de juiste diagnose van het type ziekteverwekker te stellen. [Dunbar NK et al.].

De RPA-assay is zes keer sneller dan conventionele real-time PCR en levert dezelfde analytische sensitiviteit en specificiteit op. Bovendien maakt het RPA-formaat (grootte van de apparatuur, koudeketen-onafhankelijke reagentia) snel testen op locatie haalbaar en betaalbaar. We ontwikkelden een mobiel laboratorium, dat bestaat uit een hard plastic handschoenenkastje, een Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS) en een zonnepaneel- en powerpack-set. Het gedemonteerde handschoenenkastje wordt bewaard in een metalen doos (80 × 60 × 41 cm) met andere benodigde materialen (ontsmettingsoplossing, extractiekits, filtertips, rekken, vortex, hitteblok, autoclaveerbare plastic zakken en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Het totale gewicht is 28 kg voor de doos en 16 kg voor de DiaS. Monsterinactivatie en RNA-extractie met behulp van de SE-kit werden tot nu toe in het dashboardkastje gedaan. Hierdoor konden monsters van gevarengroep 4 worden gehanteerd. De RT-RPA-assay is uitgevoerd in de DiaS met daarin het ESEQuant TS2-apparaat met geïntegreerd touchscreen om het apparaat te bedienen en de resultaten weer te geven zonder dat een laptop nodig is, die niet eenvoudig te desinfecteren is (afbeelding 1). Het mobiele lab is met succes ingezet in Conakry toen zich tegen het einde van 2014 een toenemend aantal gevallen ontwikkelde, voornamelijk als gevolg van niet-rapportage, terughoudendheid en infectieoverdrachtsketens tijdens begrafenissen. Om snel resultaat te boeken voor het programma voor veilig en waardig begraven (SDB) werden twee mobiele laboratoria opgezet in het Matoto Gbessia Port II-district. In totaal werden 928 post-mortem uitstrijkjes getest. In totaal scoorden 120 monsters (12,9%) positief. Positieve resultaten werden verkregen binnen 30-40 minuten en werden rechtstreeks gerapporteerd aan de SDB-teams [Faye O et al.].

BENADERING

Objectief:

Om de prestaties en operationele kenmerken van de differentiële RPA te beoordelen, zullen we i) een panel van goed gekarakteriseerde EBOV-sera gebruiken uit monsters verzameld in Guinee en de DRC, ii) sera van EVD-verdachte gevallen, en iii) sera van routinematige diagnostiek bij IPD en NIBR.

Studiepopulatie:

Het onderzoek zal worden uitgevoerd op materiaal van EVD-verdachten, gearchiveerde en prospectieve EBOV-negatieve monsters en geselecteerde routinematige diagnostische monsters.

In- en uitsluitingscriteria: Alle proefpersonen (mannen, vrouwen, volwassenen en kinderen) die voldoen aan de WHO-casusdefinitie van "vermoedelijk" en "waarschijnlijk" EVD-casus die in aanmerking komen voor real-time RT-PCR-assay, volgens de momenteel gebruikte casusdefinitie in de DRC. Voor de prospectieve evaluatie zal mondelinge geïnformeerde toestemming van de patiënt/wettelijke voogd worden gevraagd om in aanmerking te komen voor deelname aan het onderzoek en uitsluitingscriteria zijn onvermogen om toestemming te geven, monsters of een aandoening die de veiligheid van de proefpersoon in gevaar kan brengen.

Steekproefgrootte:

Een panel van 50-100 RT-PCR-positieve monsters voor elk differentieel pathogeen, en 50-100 RT-PCR-negatieve monsters zullen worden samengesteld en gebruikt. Met een verwachte sensitiviteit en specificiteit van de RPA-assay van 98% (betrouwbaarheidsinterval van 95%), moeten voor elke parameter minimaal 30 positieve en negatieve gevallen in het onderzoek worden opgenomen. Op basis van onze ervaring in Guinee is 10% van de RT-PCR-tests op monsters van verdachte gevallen EBOV-positief. Bijgevolg moeten 300 EVD-verdachte gevallen worden gescreend om ten minste 30 EVD-positieve monsters te verkrijgen. Een prevalentiegradiënt van P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV zou worden verwacht in de resterende 270 monsters. Het minimum aantal te testen positieven en negatieven voor elke parameter wordt berekend op basis van hun prevalentie.

Verzameling en verwerking van monsters:

Voor de prospectieve studie bij patiënten met koorts en mogelijke nieuwe EVD-uitbraken, zullen speeksel en serum worden verzameld via oraal uitstrijkje en aderpunctie volgens SOP uitgevoerd bij de EVD-uitbraak in Guinee, geharmoniseerd met SOP's die in de DRC worden gebruikt voor patiënten met EVD-symptomen die voldoen aan de protocolopname criteria. EBOV-RPA en real-time RT-PCR zullen worden uitgevoerd en de resultaten zullen worden geclassificeerd als concordant negatief of positief of discordant. Patiënten met EBOV-negatieve en positieve resultaten zullen respectievelijk worden ontslagen of in het ziekenhuis worden opgenomen volgens lokaal vastgestelde criteria. Afwijkende resultaten worden opnieuw getest op hetzelfde monster en 24 uur later wordt een aanvullend monster afgenomen. Als de discrepantie niet kan worden opgelost, worden de resultaten met de clinicus besproken om de beste beslissing te nemen voor de patiënt en de gemeenschap met betrekking tot de context. Gearchiveerde monsters worden rechtstreeks getest uit aliquots die in de vriezer zijn opgeslagen.

Protocol voor monsterextractie:

Aanvankelijk zal al het verzamelde monster worden onderworpen aan een inactiveringsstap met behulp van de lysisbuffer in de draagbare handschoenendoos van de BSL-3 (figuur 2). Twee snelle extractieprotocollen zullen worden gevalideerd en vergeleken op hun geschiktheid voor gebruik in het veld, (i) een op NaoH gebaseerd alkalisch lysisprotocol geleverd door TwistDX dat rechtstreeks kan worden gebruikt op volbloed en serum [Osmundson TW et al.], (ii) een Op filtreerpapier gebaseerde nucleïnezuurextractiemethode die totale nucleïnezuurextractie uit ruwe monsters mogelijk maakt [Zou Y et al.].

Beide protocollen duren maximaal 10 minuten. Extracten zullen naar het BSL-4-laboratorium in Winnipeg, Canada (NML) worden gestuurd om de inactivatie van het ebolavirus in het monsterextract te bevestigen door inoculatie op celkweek. De RPA wordt bediend vanuit het kofferlaboratorium, dat alle benodigde apparatuur en reagentia bevat (Figuur 1)

.

Gegevensverzameling en -opslag:

Klinische gegevens en resultaten zullen worden geregistreerd via een bestaande vragenlijst die in Guinee wordt gebruikt, geharmoniseerd met de procedures in de DRC en worden ingevoerd in een database. Gegevens omvatten, maar zijn niet beperkt tot, leeftijd, geslacht, opnamedatum, aanvangsdatum, datum van bemonstering, gedetailleerde symptomen, testresultaten, definitieve classificatie van de patiënt, ziekte-uitkomst.

Er zullen passende maatregelen voor kwaliteitscontrole worden geïmplementeerd om de betrouwbaarheid van het proces voor het verzamelen van gegevens, de naleving van het algemene beheer van de ingang en de kwaliteit van de gegenereerde gegevens te bewaken. Aan het einde van het onderzoek worden alle verzamelde gegevens gecontroleerd op kwaliteit en vergrendeld voor gegevensanalyse.

Standaard procedure:

SOP's van alle toepasselijke onderzoeksprocessen zullen beschikbaar worden gesteld.

Methoden voor gegevensanalyse:

Klinische gegevens zullen worden geanalyseerd om een ​​nauwkeurige beschrijving van de onderzoekspopulatie te geven. Elke verzamelde variabele zal worden beschreven met behulp van statistische indicatoren zoals gemiddelde, mediaan, standaarddeviatie voor kwantitatieve variabelen en frequenties voor kwalitatieve variabelen. De betrouwbaarheidsintervallen van 95% worden verstrekt, evenals significantietesten (zoals Xi-kwadraat) voor vergelijking tussen analytische en klinische prestaties van de diagnostische tests van het EVD.

Testnauwkeurigheid:

Positieve ref Negatieve ref testresultaat testresultaat Positief testresultaat TP FP

Negatief testresultaat FN TN

Gevoeligheid: aandeel van echt positieve monsters. (TP/TP+FN) Specificiteit: Aandeel echt negatieve monsters. (TN/TN+FP) De sensitiviteit en de specificiteit worden gecombineerd in een kappa-waarde om de algehele prestatie van de tests te schatten.

Test bruikbaarheid:

Er zal een scoresysteem worden ontwikkeld om de gebruiksvriendelijkheid te beoordelen