Teste de diagnóstico de ponto de atendimento móvel para a doença do vírus Ebola na RDC (MobEboDRC)

No surto de Ebola na Guiné, até 90% dos pacientes testaram negativo, mas raramente foram diagnosticados para diferenciais e a malária e outras doenças foram subdiagnosticadas, o que provavelmente levou a mais mortes por esses agentes infecciosos. Outro aspecto importante é que, o medo dos pacientes de ter Ebola, enquanto eles sofrem de outra doença, deve ser superado com o diagnóstico correto do tipo de patógeno em tempo hábil. [Dunbar NK e outros].

O ensaio RPA é seis vezes mais rápido que o PCR convencional em tempo real, ao mesmo tempo em que produz a mesma sensibilidade e especificidade analíticas. Além disso, o formato RPA (tamanho do equipamento, reagentes independentes da cadeia fria) torna os testes rápidos no local viáveis ​​e acessíveis. Desenvolvemos um laboratório móvel, que consiste em um porta-luvas de plástico rígido, um Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS) e um conjunto de painel solar e fonte de alimentação. O porta-luvas desmontado é guardado em caixa metálica (80 × 60 × 41 cm) com os demais materiais necessários (solução desinfetante, kits de extração, ponteiras filtrantes, racks, vórtice, bloco térmico, sacos plásticos autoclaváveis ​​e equipamentos de proteção individual (EPI). O peso total é de 28 kg para a caixa e 16 kg para o DiaS. A inativação da amostra e a extração de RNA usando o kit SE até agora foram feitas no porta-luvas. Isso permitiu o manuseio de amostras do grupo de risco 4. O ensaio RT-RPA foi realizado no DiaS contendo o dispositivo ESEQuant TS2 com touchscreen integrado para operar o dispositivo e exibir os resultados sem a necessidade de um laptop, que não é fácil de desinfetar (Figura 1). O laboratório móvel foi implantado com sucesso em Conakry, quando um número crescente de casos, devido principalmente à não notificação, reticência e cadeias de transmissão de infecções durante os enterros, ocorreram no final de 2014. Para fornecer resultados rápidos para o programa de enterro seguro e digno (SDB), dois laboratórios móveis foram instalados no distrito de Matoto Gbessia Port II. Ao todo, 928 amostras de zaragatoa post-mortem foram testadas. No geral, 120 amostras (12,9%) tiveram pontuação positiva. Os resultados positivos foram obtidos em 30-40 minutos e relatados diretamente às equipes SDB [Faye O et al.].

ABORDAGEM

Objetivo:

Para avaliar o desempenho e as características operacionais do RPA diferencial, usaremos i) um painel de soros EBOV bem caracterizados de amostras coletadas na Guiné e na RDC ii) soros de casos suspeitos de EVD e iii) soros de diagnósticos de rotina em IPD e NIBR.

População do estudo:

O estudo será realizado em material de pessoas suspeitas de EVD, amostras negativas de EBOV arquivadas e prospectivas e amostras de diagnóstico de rotina selecionadas.

Critérios de inclusão e exclusão: Todos os indivíduos (homens, mulheres, adultos e crianças) que atendem à definição de caso da OMS de caso "suspeito" e "provável" de EVD elegíveis para ensaio de RT-PCR em tempo real, de acordo com a definição de caso atualmente usada na RDC. Para a avaliação prospectiva, será solicitado consentimento informado oral do paciente/responsável legal para elegibilidade para participar do estudo e os critérios de exclusão serão impossibilidade de fornecer consentimento, amostras ou condição que possa comprometer a segurança do sujeito.

Tamanho da amostra:

Um painel de 50-100 amostras positivas de RT-PCR para cada patógeno diferencial e 50-100 amostras negativas de RT-PCR será montado e usado. Com uma sensibilidade e especificidade esperadas do ensaio de RPA de 98% (intervalo de confiança de 95%), um mínimo de 30 casos positivos e negativos para cada parâmetro deve ser incluído no estudo. Com base em nossa experiência na Guiné, 10% dos testes de RT-PCR em amostras de casos suspeitos são positivos para EBOV. Consequentemente, 300 casos suspeitos de EVD precisam ser rastreados para obter pelo menos 30 amostras positivas de EVD. Um gradiente de prevalência de P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV seria esperado nas 270 amostras restantes. O número mínimo de positivos e negativos a serem testados para cada parâmetro será calculado de acordo com sua prevalência.

Coleta e processamento de amostras:

Para o estudo prospectivo em pacientes febris e potenciais novos surtos de EVD, saliva e soro serão coletados por meio de swab oral e punção venosa conforme SOP realizado no surto de EVD na Guiné harmonizado com SOPs usados ​​na RDC para pacientes com sintomas de EVD em conformidade com a inclusão do protocolo critério. EBOV-RPA e RT-PCR em tempo real serão realizados e os resultados serão classificados como concordantes negativos ou positivos ou discordantes. Os pacientes com resultados negativos e positivos de EBOV receberão alta ou internação, respectivamente, de acordo com os critérios estabelecidos localmente. Resultados discordantes serão testados novamente na mesma amostra e uma suplementar coletada 24 horas depois. Se a discrepância não puder ser resolvida, os resultados serão discutidos com o clínico para tomar a melhor decisão para o paciente e as comunidades em relação ao contexto. As amostras arquivadas serão testadas diretamente das alíquotas armazenadas no freezer.

Protocolo de extração de amostra:

Inicialmente toda amostra coletada será submetida à etapa de inativação utilizando tampão de lise em caixa de luvas portátil BSL-3 (Figura 2). Dois protocolos de extração rápida serão validados e comparados quanto à sua adequação para uso em campo, (i) um protocolo de lise alcalina à base de NaoH fornecido pela TwistDX que pode ser usado diretamente em sangue total e soro [Osmundson TW et al.], (ii) um método de extração de ácido nucleico baseado em papel de filtro que permite a extração total de ácido nucleico de amostras brutas [Zou Y et al.].

Ambos os protocolos requerem no máximo 10 minutos. Os extratos serão enviados ao laboratório BSL-4 em Winnipeg, Canadá (NML), para confirmar a inativação do vírus Ebola no extrato da amostra por inoculação em cultura celular. O RPA será operado a partir do laboratório de malas, que contém todos os equipamentos e reagentes necessários (Figura 1)

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Coleta e armazenamento de dados:

Os dados e resultados clínicos serão registrados por meio de um questionário existente usado na Guiné, harmonizado com os procedimentos da RDC e inseridos em um banco de dados. Os dados incluem, entre outros, idade, sexo, data de admissão, data de início, data de amostragem, sintomas detalhados, resultados de testes, classificação final do paciente, resultado da doença.

Medidas apropriadas de controle de qualidade serão implementadas para monitorar a confiabilidade do processo de coleta de dados, conformidade da administração geral de entrada e qualidade dos dados gerados. No final do estudo, todos os dados coletados serão controlados quanto à qualidade e bloqueados para análise de dados.

Procedimento operacional Padrão:

Os POPs de todos os processos de pesquisa aplicáveis ​​serão disponibilizados.

Métodos de análise de dados:

Os dados clínicos serão analisados ​​para fornecer uma descrição precisa da população do estudo. Cada variável coletada será descrita usando indicadores estatísticos como média, mediana, desvio padrão para variáveis ​​quantitativas e frequências para variáveis ​​qualitativas. Os intervalos de confiança de 95% serão fornecidos, bem como testes de significância (como o Xi-quadrado) para comparação entre o desempenho analítico e clínico dos testes de diagnóstico de EVD.

Precisão do teste:

Ref positivo Resultado dos testes de ref negativo resultado dos testes Resultado do teste positivo TP FP

resultado de teste negativo FN TN

Sensibilidade: Proporção de amostras de verdadeiros positivos. (TP/TP+FN) Especificidade: Proporção de amostras verdadeiramente negativas. (TN/TN+FP) A sensibilidade e a especificidade serão combinadas em um valor kappa para estimar o desempenho geral dos testes.

Utilidade do teste:

Um sistema de pontuação será desenvolvido para avaliar a facilidade de uso