Диагностическое тестирование, вызванное вирусом Эбола, в Мобильном пункте оказания медицинской помощи в ДРК (MobEboDRC)

Во время вспышки лихорадки Эбола в Гвинее до 90% пациентов дали отрицательный результат, но редко диагностировались для дифференциальной диагностики, а малярия и другие заболевания не диагностировались, что, скорее всего, привело к большему количеству смертей от этих инфекционных агентов. Другим важным аспектом является то, что страх пациентов перед лихорадкой Эбола, в то время как они страдают от другого заболевания, должен быть преодолен путем своевременной постановки правильного диагноза типа возбудителя. [Данбар Н.К. и др.].

Анализ RPA в шесть раз быстрее, чем обычная ПЦР в реальном времени, обеспечивая при этом ту же аналитическую чувствительность и специфичность. Кроме того, формат RPA (размер оборудования, независимые от холодовой цепи реагенты) делает возможным и доступным быстрое тестирование на месте. Мы разработали мобильную лабораторию, которая состоит из жесткого пластикового перчаточного ящика «Диагностика в чемодане» (DiaS), солнечной панели и блока питания. Перчаточный бокс в разобранном виде хранится в металлическом ящике (80 × 60 × 41 см) с другими необходимыми материалами (дезинфицирующий раствор, комплекты для экстракции, фильтрующие наконечники, стойки, вортекс, термоблок, автоклавируемые полиэтиленовые пакеты и средства индивидуальной защиты (СИЗ). Общий вес составляет 28 кг для коробки и 16 кг для DiaS. Инактивация образцов и выделение РНК с использованием набора SE до сих пор выполнялись в перчаточном боксе. Это позволило работать с пробами 4 группы опасности. Анализ RT-RPA был выполнен в DiaS, содержащем устройство ESEQuant TS2 со встроенным сенсорным экраном для управления устройством и отображения результатов без использования ноутбука, который нелегко дезинфицировать (рис. 1). Мобильная лаборатория была успешно развернута. в Конакри, когда к концу 2014 года увеличилось число случаев, в основном из-за несообщения, скрытности и цепочек передачи инфекции во время захоронений. Для быстрого получения результатов по программе безопасного и достойного захоронения (SDB) в районе порта II Матото Гбессия были созданы две мобильные лаборатории. Всего было протестировано 928 образцов посмертных мазков. В целом 120 образцов (12,9%) дали положительный результат. Положительные результаты были получены в течение 30–40 минут, и о них сообщалось непосредственно командам SDB [Faye O et al.].

ПОДХОД

Цель:

Для оценки характеристик и рабочих характеристик дифференциального RPA мы будем использовать i) панель хорошо охарактеризованных сывороток EBOV из образцов, собранных в Гвинее и ДРК, ii) сыворотки от случаев с подозрением на БВВЭ и iii) сыворотки из рутинной диагностики в IPD и NIBR.

Исследуемая популяция:

Исследование будет проводиться на материалах лиц с подозрением на БВВЭ, архивных и предполагаемых отрицательных образцах EBOV и отобранных образцах для плановой диагностики.

Критерии включения и исключения: все субъекты (мужчины, женщины, взрослые и дети), соответствующие определению случая ВОЗ для «подозрения» и «вероятного» случая БВВЭ, подходящие для анализа ОТ-ПЦР в реальном времени в соответствии с определением случая, используемым в настоящее время в ДРК. Для проспективной оценки будет запрошено устное информированное согласие пациента/законного опекуна на право участия в исследовании, а критерием исключения будет невозможность предоставить согласие, образцы или условия, которые могут поставить под угрозу безопасность субъекта.

Размер образца:

Будет собрана и использована панель из 50-100 положительных образцов ОТ-ПЦР для каждого дифференциального патогена и 50-100 отрицательных образцов ОТ-ПЦР. При ожидаемой чувствительности и специфичности анализа RPA 98 % (доверительный интервал 95 %) в исследование должно быть включено не менее 30 положительных и отрицательных случаев по каждому параметру. Основываясь на нашем опыте в Гвинее, 10% тестов RT-PCR на образцах от подозрительных случаев дают положительный результат на EBOV. Следовательно, необходимо провести скрининг 300 случаев с подозрением на БВВЭ, чтобы получить как минимум 30 положительных образцов на БВВЭ. В оставшихся 270 образцах можно ожидать градиент распространенности P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV. Минимальное количество положительных и отрицательных результатов для каждого параметра будет рассчитано в соответствии с их распространенностью.

Сбор и обработка образцов:

Для проспективного исследования у лихорадящих пациентов и потенциальных новых вспышек БВВЭ слюна и сыворотка будут собираться с помощью орального мазка и венепункции в соответствии с СОП, выполненными при вспышке БВВЭ в Гвинее, согласованными с СОП, используемыми в ДРК для пациентов с симптомами БВВЭ, соответствующих включению в протокол критерии. Будут проведены EBOV-RPA и RT-PCR в реальном времени, и результаты будут классифицированы как согласующиеся отрицательные, положительные или несогласующиеся. Пациенты с отрицательными и положительными результатами EBOV будут соответственно выписаны или госпитализированы в соответствии с критериями, установленными на местном уровне. Несоответствующие результаты будут повторно проверены на том же образце, а дополнительный образец будет собран через 24 часа. Если несоответствие не может быть устранено, результаты будут обсуждаться с клиницистом, чтобы принять наилучшее решение для пациента и сообщества в зависимости от контекста. Архивные образцы будут протестированы непосредственно из аликвот, хранящихся в морозильной камере.

Пример протокола извлечения:

Первоначально весь собранный образец будет подвергнут этапу инактивации с использованием лизирующего буфера в переносном перчаточном боксе BSL-3 (рис. 2). Два протокола быстрой экстракции будут проверены и сравнены на предмет их пригодности для использования в полевых условиях: (i) протокол щелочного лизиса на основе NaoH, предоставленный TwistDX, который можно использовать непосредственно на цельной крови и сыворотке [Osmundson TW et al.], (ii) метод экстракции нуклеиновых кислот на основе фильтровальной бумаги, позволяющий полностью экстрагировать нуклеиновые кислоты из неочищенных образцов [Zou Y et al.].

Оба протокола требуют максимум 10 минут. Экстракты будут отправлены в лабораторию BSL-4 в Виннипеге, Канада (NML), для подтверждения инактивации вируса Эбола в экстракте образца путем посева на клеточную культуру. RPA будет работать из чемодана-лаборатории, в котором есть все необходимое оборудование и реагенты (рис. 1).

.

Сбор и хранение данных:

Клинические данные и результаты будут зарегистрированы с помощью существующего вопросника, используемого в Гвинее, унифицированного с процедурами в ДРК и внесенного в базу данных. Данные включают, помимо прочего, возраст, пол, дату госпитализации, дату начала заболевания, дату взятия образцов, подробные симптомы, результаты тестирования, окончательную классификацию пациента, исход заболевания.

Будут реализованы надлежащие меры контроля качества для мониторинга надежности процесса сбора данных, соблюдения требований общего управления вводом данных и качества генерируемых данных. В конце исследования все собранные данные будут проверены на качество и заблокированы для анализа данных.

Стандартная рабочая процедура:

СОПы всех применимых исследовательских процессов будут доступны.

Методы анализа данных:

Клинические данные будут проанализированы, чтобы дать точное описание исследуемой популяции. Каждая собранная переменная будет описана с использованием статистических показателей, таких как среднее значение, медиана, стандартное отклонение для количественных переменных и частоты для качественных переменных. Будут предоставлены 95% доверительные интервалы, а также тесты значимости (такие как Xi-квадрат) для сравнения аналитической и клинической эффективности диагностических тестов БВВЭ.

Точность теста:

Положительный реф. Отрицательный реф. Результат тестов Результат тестов Положительный результат теста TP FP

Отрицательный результат теста FN TN

Чувствительность: доля истинно положительных образцов. (TP/TP+FN) Специфичность: Доля истинно отрицательных образцов. (TN/TN+FP) Чувствительность и специфичность будут объединены в каппа-значении для оценки общей эффективности тестов.

Полезность теста:

Будет разработана система баллов для оценки удобства использования.