Mobile Point of Care Diagnostisk test for ebolavirussygdom i DRC (MobEboDRC)

I ebola-udbruddet i Guinea testede op til 90% af patienterne negative, men blev sjældent diagnosticeret for forskelle, og malaria og andre sygdomme blev underdiagnosticeret, hvilket højst sandsynligt førte til flere dødsfald fra disse smitsomme stoffer. Et andet vigtigt aspekt er, at patienternes frygt for at få ebola, mens de lider af anden sygdom, skal overvindes ved at stille den korrekte diagnose af patogenets type rettidigt. [Dunbar NK et al.].

RPA-analysen er seks gange hurtigere end konventionel realtids-PCR, mens den giver den samme analytiske sensitivitet og specificitet. Derudover gør RPA-formatet (udstyrsstørrelse, kølekædeuafhængige reagenser) hurtig on-site test mulig og overkommelig. Vi udviklede et mobilt laboratorium, som består af et handskerum i hård plast, en Diagnostics-in-a-suitcase (DiaS) og et solcellepanel og strømpakkesæt. Det adskilte handskerum opbevares i en metalboks (80 × 60 × 41 cm) med andre nødvendige materialer (desinfektionsopløsning, ekstraktionssæt, filterspidser, stativer, vortex, varmeblok, autoklaverbare plastikposer og personligt beskyttelsesudstyr (PPE). Den samlede vægt er 28 kg for kassen og 16 kg for DiaS. Prøveinaktivering og RNA-ekstraktion ved hjælp af SE-kittet indtil videre blev udført i handskerummet. Dette tillod håndtering af faregruppe 4 prøver. RT-RPA-analysen blev udført i DiaS, der indeholdt ESEQuant TS2-enheden med integreret berøringsskærm til at betjene enheden og vise resultaterne uden behov for en bærbar computer, som ikke er let at desinficere (figur 1). Det mobile laboratorium blev implementeret med succes i Conakry, da et stigende antal tilfælde, primært på grund af manglende rapportering, tilbageholdenhed og infektionsoverførselskæder under begravelser udviklede sig mod slutningen af ​​2014. For at give hurtige resultater for programmet for sikker og værdig begravelse (SDB) blev der oprettet to mobile laboratorier i Matoto Gbessia Port II-distriktet. I alt 928 post-mortem podningsprøver blev testet. Samlet set scorede 120 prøver (12,9%) positive. Positive resultater blev opnået inden for 30-40 minutter og rapporteret direkte til SDB-holdene [Faye O et al.].

NÆRME SIG

Objektiv:

For at vurdere ydeevnen og operationelle karakteristika af den differentielle RPA vil vi bruge i) et panel af velkarakteriserede EBOV-sera fra prøver indsamlet i Guinea og DRC ii) sera fra EVD-mistænkte tilfælde og iii) sera fra rutinediagnostik ved IPD og NIBR.

Undersøgelsespopulation:

Undersøgelsen vil blive udført på materiale fra EVD-mistænkte personer, arkiverede og potentielle EBOV-negative prøver og udvalgte rutinediagnostiske prøver.

Inklusions- og eksklusionskriterier: Alle forsøgspersoner (mænd, kvinder, voksne og børn), der opfylder WHO's case-definition af "mistænkt" og "sandsynlig" EVD-tilfælde, der er kvalificerede til real-time RT-PCR-assay i henhold til den aktuelt anvendte case-definition i DRC. Til den prospektive evaluering vil der blive anmodet om mundtligt informeret samtykke fra patienten/værgen for at være berettiget til at deltage i undersøgelsen, og eksklusionskriterier vil være manglende evne til at give samtykke, prøver eller tilstand, der kan bringe forsøgspersonens sikkerhed i fare.

Prøvestørrelse:

Et panel med 50-100 RT-PCR-positive prøver for hvert differentielt patogen og 50-100 RT-PCR-negative prøver vil blive samlet og brugt. Med en forventet RPA-analysefølsomhed og specificitet på 98 % (konfidensinterval på 95 %), skal minimum 30 positive og negative tilfælde for hver parameter inkluderes i undersøgelsen. Baseret på vores erfaring i Guinea er 10 % af RT-PCR-tests på prøver fra mistænkte tilfælde EBOV-positive. Derfor skal 300 formodede EVD-tilfælde screenes for at opnå mindst 30 EVD-positive prøver. En prævalensgradient af P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV ville forventes i de resterende 270 prøver. Minimumsantallet af positive og negative, der skal testes for hver parameter, vil blive beregnet i henhold til deres prævalens.

Indsamling og behandling af prøver:

Til det prospektive studie i febrile patienter og potentielle nye EVD-udbrud, vil spyt og serum blive indsamlet via oral podning og venepunktur i henhold til SOP udført i EVD-udbruddet i Guinea harmoniseret med SOP'er brugt i DRC for patienter med EVD-symptomer, der overholder protokollens inklusion kriterier. EBOV-RPA og real-time RT-PCR vil blive udført, og resultater vil blive klassificeret som konkordant negative eller positive eller disharmoniske. Patienter med EBOV negative og positive resultater vil henholdsvis blive udskrevet eller indlagt efter lokalt fastlagte kriterier. Uoverensstemmende resultater vil blive testet igen på den samme prøve og en supplerende en indsamlet 24 timer senere. Hvis uoverensstemmelsen ikke kan løses, vil resultaterne blive diskuteret med klinikeren for at træffe den bedste beslutning for patienten og lokalsamfundene vedrørende konteksten. Arkiverede prøver vil blive testet direkte fra alikvoter opbevaret i fryseren.

Prøveekstraktionsprotokol:

Indledningsvis vil al indsamlet prøve blive udsat for inaktiveringstrin ved hjælp af lyseringsbuffer i BSL-3 bærbar handskeboks (figur 2). To hurtige ekstraktionsprotokoller vil blive valideret og sammenlignet for deres egnethed til brug i marken, (i) en NaoH-baseret alkalisk lyseringsprotokol leveret af TwistDX, som kan bruges direkte på fuldblod og serum [Osmundson TW et al.], (ii) en filterpapirbaseret nukleinsyreekstraktionsmetode, der tillader total nukleinsyreekstraktion fra råprøver [Zou Y et al.].

Begge protokoller kræver maksimalt 10 minutter. Ekstrakter vil blive sendt til BSL-4-laboratoriet i Winnipeg, Canada (NML), for at bekræfte inaktivering af ebola-virus i prøveekstraktet ved inokulering på cellekultur. RPA'en vil blive betjent fra kuffertlaboratoriet, som indeholder alt udstyr og reagenser, der er nødvendige (Figur 1)

.

Dataindsamling og opbevaring:

Kliniske data og resultater vil blive registreret via et eksisterende spørgeskema, der bruges i Guinea, harmoniseret til procedurer i DRC og indlæst i en database. Data inkluderer, men er ikke begrænset til, alder, køn, indlæggelsesdato, dato for debut, dato for prøveudtagning, detaljerede symptomer, resultater af test, endelig klassificering af patienten, sygdomsudfald.

Der vil blive implementeret passende kvalitetskontrolforanstaltninger for at overvåge pålideligheden af ​​processen for dataindsamling, indtastning af generel ledelsesoverholdelse og for kvaliteten af ​​de genererede data. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen vil alle indsamlede data blive kontrolleret for kvalitet og låst til dataanalyse.

Standard operationsprocedure:

SOP'er for alle relevante forskningsprocesser vil blive gjort tilgængelige.

Dataanalysemetoder:

Kliniske data vil blive analyseret for at give en nøjagtig beskrivelse af undersøgelsespopulationen. Hver indsamlet variabel vil blive beskrevet ved hjælp af statistiske indikatorer såsom middelværdi, median, standardafvigelse for kvantitative variable og frekvenser for kvalitative variable. De 95 % konfidensintervaller vil blive leveret såvel som signifikanstest (såsom Xi-square) til sammenligning mellem analytisk og klinisk ydeevne af EVD-diagnostiske tests.

Test nøjagtighed:

Positiv ref Negativ ref-test resultat testresultat Positivt testresultat TP FP

Negativt testresultat FN TN

Sensitivitet: Andel af prøver af sande positive. (TP/TP+FN) Specificitet: Andel af sande negative prøver. (TN/TN+FP) Sensitiviteten og specificiteten vil blive kombineret i en kappa-værdi for at estimere testens samlede præstation.

Test anvendelighed:

Der vil blive udviklet et scoringssystem for at vurdere brugervenligheden