Diagnostické testování mobilního bodu péče na onemocnění virem Ebola v DRC (MobEboDRC)

Při vypuknutí eboly v Guineji až 90 % pacientů bylo testováno negativně, ale jen zřídka byli diagnostikováni na rozdíly a malárie a další nemoci byly poddiagnostikovány, což s největší pravděpodobností vedlo k většímu počtu úmrtí na tyto infekční agens. Dalším důležitým aspektem je, že strach pacientů z toho, že mají ebolu, zatímco trpí jiným onemocněním, musí být překonán včasným stanovením správné diagnózy typu patogenu. [Dunbar NK a kol.].

Test RPA je šestkrát rychlejší než konvenční PCR v reálném čase, přičemž poskytuje stejnou analytickou citlivost a specificitu. Navíc formát RPA (velikost zařízení, nezávislá reagencie studeného řetězce) umožňuje rychlé a cenově dostupné testování na místě. Vyvinuli jsme mobilní laboratoř, která se skládá z příruční schránky z tvrdého plastu, Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS) a solárního panelu a sady napájecího zdroje. Demontovaná odkládací schránka je uložena v kovové krabici (80 × 60 × 41 cm) s dalším potřebným materiálem (dezinfekční roztok, extrakční sady, filtrační špičky, stojany, vortex, tepelný blok, autoklávovatelné plastové sáčky a osobní ochranné prostředky (OOP). Celková hmotnost je 28 kg pro box a 16 kg pro DiaS. Inaktivace vzorků a extrakce RNA pomocí soupravy SE se dosud prováděly v rukavicovém boxu. To umožnilo manipulaci se vzorky 4. skupiny nebezpečnosti. Test RT-RPA byl proveden v DiaS obsahujícím zařízení ESEQuant TS2 s integrovanou dotykovou obrazovkou pro ovládání zařízení a zobrazení výsledků bez potřeby notebooku, který není snadné dezinfikovat (obrázek 1). Mobilní laboratoř byla úspěšně nasazena v Conakry, kdy se ke konci roku 2014 rozvinul rostoucí počet případů, zejména v důsledku nenahlášení, zdrženlivosti a řetězců přenosu infekce během pohřbů. Pro zajištění rychlých výsledků pro program bezpečného a důstojného pohřbu (SDB) byly v okrese Matoto Gbessia Port II zřízeny dvě mobilní laboratoře. Celkem bylo testováno 928 vzorků posmrtných výtěrů. Celkově bylo pozitivních 120 vzorků (12,9 %). Pozitivní výsledky byly získány během 30-40 minut a byly hlášeny přímo týmům SDB [Faye O et al.].

PŘÍSTUP

Objektivní:

K posouzení výkonů a provozních charakteristik diferenciální RPA použijeme i) panel dobře charakterizovaných sér EBOV ze vzorků odebraných v Guineji a DRC, ii) séra z případů podezřelých na EVD a iii) séra z rutinní diagnostiky na IPD a NIBR.

Studijní populace:

Studie bude provedena na materiálu od osob podezřelých z eboly, archivovaných a prospektivních EBOV negativních vzorků a vybraných rutinních diagnostických vzorků.

Kritéria pro zařazení a vyloučení: Všichni jedinci (muži, ženy, dospělí a děti), kteří splňují definici případu WHO jako „podezřelý“ a „pravděpodobný“ případ EVD, způsobilí pro test RT-PCR v reálném čase, podle aktuálně používané definice případu v DRC. Pro prospektivní hodnocení bude pro způsobilost k účasti ve studii vyžadován ústní informovaný souhlas pacienta/zákonného zástupce a vylučovacími kritérii bude neschopnost poskytnout souhlas, vzorky nebo stav, který by mohl ohrozit bezpečnost subjektu.

Velikost vzorku:

Bude sestaven a použit panel 50-100 RT-PCR pozitivních vzorků pro každý rozdílný patogen a 50-100 RT-PCR negativních vzorků. Při očekávané citlivosti a specificitě testu RPA 98 % (interval spolehlivosti 95 %) se do studie zahrne minimálně 30 pozitivních a negativních případů pro každý parametr. Na základě našich zkušeností v Guineji je 10 % testů RT-PCR na vzorcích z podezřelých případů EBOV pozitivních. V důsledku toho je třeba provést screening 300 případů podezření na EVD, aby se získalo alespoň 30 vzorků pozitivních na EVD. Gradient prevalence P. falciparum > S. typhi > DENV > YFV by se dal očekávat u zbývajících 270 vzorků. Minimální počet pozitivních a negativních testů pro každý parametr bude vypočítán podle jejich prevalence.

Sběr a zpracování vzorků:

Pro prospektivní studii u febrilních pacientů a potenciálních nových propuknutí EVD budou sliny a sérum odebírány pomocí ústního výtěru a venepunkce podle standardního postupu provedeného při propuknutí EVD v Guineji v souladu se standardními operačními postupy používanými v DRC pro pacienty se symptomy EVD v souladu se zařazením do protokolu kritéria. Provede se EBOV-RPA a RT-PCR v reálném čase a výsledky budou klasifikovány jako souhlasné negativní nebo pozitivní nebo nesouhlasné. Pacienti s negativními a pozitivními výsledky EBOV budou propuštěni nebo hospitalizováni podle místně stanovených kritérií. Neshodné výsledky budou znovu testovány na stejném vzorku a na doplňkovém vzorku odebraném o 24 hodin později. Pokud nelze nesrovnalosti vyřešit, budou výsledky prodiskutovány s klinikem, aby bylo možné učinit nejlepší rozhodnutí pro pacienta a komunity ohledně kontextu. Archivované vzorky budou testovány přímo z alikvotů uložených v mrazáku.

Vzorový protokol extrakce:

Zpočátku budou všechny odebrané vzorky podrobeny kroku inaktivace pomocí lyzačního pufru v přenosném rukavicovém boxu BSL-3 (obrázek 2). Dva protokoly rychlé extrakce budou validovány a porovnány z hlediska jejich vhodnosti pro použití v terénu, (i) protokol alkalické lýzy založený na NaoH poskytovaný společností TwistDX, který lze použít přímo na plnou krev a sérum [Osmundson TW et al.], (ii) a metoda extrakce nukleové kyseliny na filtračním papíru umožňující úplnou extrakci nukleové kyseliny ze surových vzorků [Zou Y et al.].

Oba protokoly vyžadují maximálně 10 minut. Extrakty budou zaslány do laboratoře BSL-4 ve Winnipegu v Kanadě (NML), aby se potvrdila inaktivace viru Ebola v extraktu vzorku inokulací na buněčnou kulturu. RPA bude řízena z kufrové laboratoře, která obsahuje veškeré potřebné vybavení a činidla (obrázek 1)

.

Sběr a ukládání dat:

Klinické údaje a výsledky budou zaznamenávány prostřednictvím stávajícího dotazníku používaného v Guineji, harmonizovány s postupy v DRC a vloženy do databáze. Údaje zahrnují, ale nejsou omezeny na věk, pohlaví, datum přijetí, datum nástupu, datum odběru vzorků, podrobné příznaky, výsledky testování, konečnou klasifikaci pacienta, výsledek onemocnění.

Budou zavedena příslušná opatření pro kontrolu kvality pro sledování spolehlivosti procesu sběru dat, dodržování požadavků obecného managementu na vstupu a kvality generovaných dat. Na konci studie budou všechna shromážděná data zkontrolována z hlediska kvality a uzamčena pro analýzu dat.

Standardní operační postup:

Budou zpřístupněny standardní operační postupy všech použitelných výzkumných procesů.

Metody analýzy dat:

Klinická data budou analyzována, aby poskytla přesný popis studované populace. Každá shromážděná proměnná bude popsána pomocí statistických ukazatelů, jako je průměr, medián, směrodatná odchylka pro kvantitativní proměnné a frekvence pro kvalitativní proměnné. Budou poskytnuty 95% intervaly spolehlivosti a také testy významnosti (jako je Xi-kvadrát) pro srovnání analytické a klinické výkonnosti diagnostických testů EVD.

Přesnost testu:

Pozitivní ref Negativní výsledek ref testů výsledek testů Pozitivní výsledek testu TP FP

Negativní výsledek testu FN TN

Citlivost: Podíl skutečně pozitivních vzorků. (TP/TP+FN) Specifičnost: Podíl skutečně negativních vzorků. (TN/TN+FP) Senzitivita a specificita budou kombinovány v hodnotě kappa, aby se odhadl celkový výkon testů.

Užitečnost testu:

K posouzení uživatelské přívětivosti bude vyvinut bodovací systém