Mobile Point of Care -diagnostiikkatestaus Ebola-virustaudin varalta Kongon demokraattisessa tasavallassa (MobEboDRC)

Ebola-epidemian puhkeamisessa Guineassa jopa 90 % potilaista oli negatiivinen, mutta heillä diagnosoitiin harvoin eroja, ja malaria ja muut sairaudet jäivät alidiagnosoiduiksi, mikä todennäköisimmin johtaa useampaan näiden tartuntatautien aiheuttamien kuolemien määrään. Toinen tärkeä näkökohta on, että potilaiden pelko saada Ebola, kun he kärsivät muusta sairaudesta, on voitettava antamalla oikea taudinaiheuttajatyypin diagnoosi ajoissa. [Dunbar NK et ai.].

RPA-määritys on kuusi kertaa nopeampi kuin perinteinen reaaliaikainen PCR, samalla kun se tuottaa saman analyyttisen herkkyyden ja spesifisyyden. Lisäksi RPA-formaatti (laitteiston koko, kylmäketjusta riippumattomat reagenssit) tekee nopeasta paikan päällä testauksesta mahdollista ja edullista. Kehitimme liikkuvan laboratorion, joka koostuu kovamuovisesta hansikaslokerosta, Diagnostics-in-a-Suitcasesta (DiaS) sekä aurinkopaneelista ja tehopakkaussarjasta. Purettu hansikaslokero säilytetään metallilaatikossa (80 × 60 × 41 cm), jossa on muita tarvittavia materiaaleja (desinfiointiaine, poistosarjat, suodatinkärjet, telineet, vortex, lämpölohko, autoklavoitavat muovipussit ja henkilönsuojaimet). Laatikon kokonaispaino on 28 kg ja DiaS:n 16 kg. Näytteen inaktivointi ja RNA:n uuttaminen SE-sarjalla tähän mennessä tehtiin hansikaslokerossa. Tämä mahdollisti vaararyhmän 4 näytteiden käsittelyn. RT-RPA-määritys suoritettiin DiaS:ssä, joka sisälsi ESEQuant TS2 -laitteen integroidulla kosketusnäytöllä laitteen käyttämiseksi ja tulosten näyttämiseksi ilman kannettavaa tietokonetta, jota ei ole helppo desinfioida (kuva 1). Mobiililaboratorio otettiin käyttöön onnistuneesti Conakryssa, kun vuoden 2014 loppua kohti kehittyi lisääntyvä määrä tapauksia, jotka johtuvat pääasiassa ilmoittamatta jättämisestä, pidättymisestä ja tartunnan leviämisketjuista hautaamisen aikana. Turvallisen ja arvokkaan hautausohjelman (SDB) nopeiden tulosten saamiseksi Matoto Gbessia Port II -alueelle perustettiin kaksi liikkuvaa laboratoriota. Kaikkiaan testattiin 928 post mortem -puikkonäytettä. Kaiken kaikkiaan 120 näytettä (12,9 %) antoi positiivisen tuloksen. Positiiviset tulokset saatiin 30-40 minuutissa, ja ne ilmoitettiin suoraan SDB-tiimeille [Faye O et al.].

LÄHESTYÄ

Tavoite:

Differentiaalisen RPA:n suorituskyvyn ja toiminnallisten ominaisuuksien arvioimiseksi käytämme i) paneelia hyvin karakterisoituja EBOV-seerumeja Guineasta ja Kongon demokraattisesta tasavallasta kerätyistä näytteistä ii) seerumeita EVD-epäillyistä tapauksista ja iii) seerumeita IPD:n ja NIBR:n rutiinidiagnostiikasta.

Tutkimuspopulaatio:

Tutkimus tehdään EVD-epäiltyjen henkilöiden materiaalilla, arkistoiduilla ja mahdollisilla EBOV-negatiivisilla näytteillä sekä valituilla rutiinidiagnostisilla näytteillä.

Sisällys- ja poissulkemiskriteerit: Kaikki tutkittavat (miehet, naiset, aikuiset ja lapset), jotka täyttävät WHO:n "epäillyn" ja "todennäköisen" EVD-tapauksen määritelmän, jotka ovat kelvollisia reaaliaikaiseen RT-PCR-määritykseen Kongon demokraattisessa tasavallassa tällä hetkellä käytetyn tapausmääritelmän mukaan. Prospektiivista arviointia varten pyydetään potilaan/laillisen huoltajan suullinen tietoinen suostumus tutkimukseen osallistumista varten, ja poissulkemiskriteerinä on kyvyttömyys toimittaa suostumusta, näytteitä tai ehtoja, jotka voivat vaarantaa tutkittavan turvallisuuden.

Otoskoko:

Kootaan ja käytetään 50–100 RT-PCR-positiivisen näytteen paneeli kutakin differentiaalista patogeenia kohden ja 50–100 RT-PCR-negatiivista näytettä. Kun RPA-määrityksen oletettu herkkyys ja spesifisyys on 98 % (luottamusväli 95 %), tutkimukseen on sisällytettävä vähintään 30 positiivista ja negatiivista tapausta kustakin parametrista. Guineasta saatujen kokemustemme perusteella 10 % epäiltyjen tapausten näytteistä tehdyistä RT-PCR-testeistä on EBOV-positiivisia. Näin ollen 300 epäiltyä EVD-tapausta on seulottava, jotta saadaan vähintään 30 EVD-positiivista näytettä. P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV esiintyvyysgradientti olisi odotettavissa jäljellä olevissa 270 näytteessä. Testattavien positiivisten ja negatiivisten tulosten vähimmäismäärä kullekin parametrille lasketaan niiden esiintyvyyden mukaan.

Näytteiden keräys ja käsittely:

Prospektiivista tutkimusta kuumepotilailla ja mahdollisilla uusilla EVD-epidemioilla sylki ja seerumi kerätään vanupuikolla ja venepunktiolla Guinean EVD-epidemian yhteydessä suoritetun SOP:n mukaisesti, joka on yhdenmukaistettu Kongon demokraattisessa tasavallassa käytettyjen SOP-menetelmien kanssa potilaille, joilla on EVD-oireita ja jotka noudattavat protokollaa. kriteeri. EBOV-RPA ja reaaliaikainen RT-PCR suoritetaan ja tulokset luokitellaan yhtäpitäviksi negatiivisiksi tai positiivisiksi tai ristiriitaisiksi. Potilaat, joiden EBOV-tulos on negatiivinen ja positiivinen, kotiutetaan tai viedään sairaalaan paikallisten kriteerien mukaisesti. Ristiriitaiset tulokset testataan uudelleen samasta näytteestä ja täydentävästä näytteestä kerätään 24 tuntia myöhemmin. Jos ristiriitaa ei voida ratkaista, tuloksista keskustellaan kliinikon kanssa parhaan mahdollisen päätöksen tekemiseksi potilaalle ja yhteisöille kontekstin suhteen. Arkistoidut näytteet testataan suoraan pakastimessa säilytetyistä eristä.

Näytteenpoistoprotokolla:

Aluksi kaikki kerätyt näytteet alistetaan inaktivointivaiheeseen käyttämällä BSL-3:n kannettavassa hansikaskotelossa olevaa lyysipuskuria (kuva 2). Kaksi nopeaa uuttoprotokollaa validoidaan ja verrataan niiden soveltuvuuden kenttäkäyttöön, (i) NaoH-pohjainen alkalinen lyysiprotokolla, jonka tarjoaa TwistDX, jota voidaan käyttää suoraan kokoveressä ja seerumissa [Osmundson TW et al.], (ii) a suodatinpaperipohjainen nukleiinihappouuttomenetelmä, joka mahdollistaa kokonaisnukleiinihapon uuttamisen raakanäytteistä [Zou Y et ai.].

Molemmat protokollat ​​vaativat enintään 10 minuuttia. Uutteet lähetetään BSL-4-laboratorioon Winnipegiin, Kanadaan (NML), jotta varmistetaan Ebola-viruksen inaktivoituminen näyteuutteessa inokulaatiolla soluviljelmään. RPA:ta ohjataan matkalaukkulaboratoriosta, joka sisältää kaikki tarvittavat laitteet ja reagenssit (kuva 1)

.

Tiedonkeruu ja tallennus:

Kliiniset tiedot ja tulokset tallennetaan Guineassa käytettävään olemassa olevaan kyselyyn, joka on yhdenmukaistettu Kongon demokraattisen tasavallan menettelyihin ja tallennetaan tietokantaan. Tietoja ovat muun muassa ikä, sukupuoli, vastaanottopäivä, alkamispäivä, näytteenottopäivämäärä, yksityiskohtaiset oireet, testitulokset, potilaan lopullinen luokittelu, sairauden lopputulos.

Asianmukaiset laadunvalvontatoimenpiteet toteutetaan tiedonkeruuprosessin luotettavuuden, yleisen hallinnan vaatimustenmukaisuuden ja tuotettujen tietojen laadun valvomiseksi. Tutkimuksen lopussa kaikkien kerättyjen tietojen laatua valvotaan ja ne lukitaan tietojen analysointia varten.

Vakiotoimintamenettely:

Kaikkien sovellettavien tutkimusprosessien SOP:t asetetaan saataville.

Tietojen analysointimenetelmät:

Kliiniset tiedot analysoidaan, jotta saadaan tarkka kuvaus tutkimuspopulaatiosta. Jokainen kerätty muuttuja kuvataan käyttämällä tilastollisia indikaattoreita, kuten keskiarvoa, mediaania, keskihajontaa kvantitatiivisille muuttujille ja frekvenssiä laadullisille muuttujille. 95 %:n luottamusvälit sekä merkitsevyystestit (kuten Xi-neliö) annetaan EVD-diagnostisten testien analyyttisen ja kliinisen suorituskyvyn vertailua varten.

Testin tarkkuus:

Positiivinen ref Negatiivinen ref testien tulos testien tulos Positiivinen testitulos TP FP

Negatiivinen testitulos FN TN

Herkkyys: Todellisten positiivisten näytteiden osuus. (TP/TP+FN) Spesifisyys: Todellisten negatiivisten näytteiden osuus. (TN/TN+FP) Herkkyys ja spesifisyys yhdistetään kappa-arvoon testien yleisen suorituskyvyn arvioimiseksi.

Testin hyödyllisyys:

Käyttäjäystävällisyyden arvioimiseksi kehitetään pisteytysjärjestelmä