Mobilne testy diagnostyczne w punkcie opieki na obecność wirusa Ebola w DRK (MobEboDRC)

Podczas wybuchu epidemii eboli w Gwinei do 90% pacjentów uzyskało wynik negatywny, ale rzadko zdiagnozowano u nich różnice, a malaria i inne choroby nie zostały zdiagnozowane, co najprawdopodobniej prowadzi do większej liczby zgonów z powodu tych czynników zakaźnych. Innym ważnym aspektem jest to, że strach pacjentów przed ebolą, gdy cierpią na inną chorobę, musi zostać przezwyciężony poprzez postawienie na czas prawidłowej diagnozy rodzaju patogenu. [Dunbar NK i in.].

Test RPA jest sześć razy szybszy niż konwencjonalny PCR w czasie rzeczywistym, zapewniając jednocześnie taką samą czułość i specyficzność analityczną. Ponadto format RPA (rozmiar sprzętu, odczynniki niezależne od łańcucha chłodniczego) sprawia, że ​​szybkie testowanie na miejscu jest wykonalne i niedrogie. Opracowaliśmy mobilne laboratorium, które składa się z twardego plastikowego schowka na rękawiczki, diagnostyki w walizce (DiaS) oraz zestawu paneli słonecznych i zasilacza. Zdemontowany schowek jest przechowywany w metalowym pudełku (80 × 60 × 41 cm) wraz z innymi niezbędnymi materiałami (roztworem dezynfekującym, zestawami do ekstrakcji, końcówkami filtrów, stojakami, wirami, blokiem grzejnym, plastikowymi torbami nadającymi się do sterylizacji w autoklawie i środkami ochrony indywidualnej). Całkowita waga wynosi 28 kg dla pudełka i 16 kg dla DiaS. Inaktywacja próbki i ekstrakcja RNA za pomocą zestawu SE do tej pory odbywały się w schowku. Umożliwiło to obchodzenie się z próbkami grupy zagrożenia 4. Test RT-RPA przeprowadzono w DiaS zawierającym urządzenie ESEQuant TS2 ze zintegrowanym ekranem dotykowym do obsługi urządzenia i wyświetlania wyników bez konieczności korzystania z laptopa, który nie jest łatwy do dezynfekcji (Rysunek 1). Mobilne laboratorium zostało pomyślnie wdrożone w Konakry, kiedy pod koniec 2014 roku rozwijała się rosnąca liczba przypadków, głównie z powodu niezgłaszania się, powściągliwości i łańcuchów przenoszenia infekcji podczas pochówków. Aby zapewnić szybkie wyniki programu bezpiecznego i godnego pochówku (SDB), w dzielnicy Matoto Gbessia Port II utworzono dwa mobilne laboratoria. W sumie zbadano 928 próbek wymazów pobranych pośmiertnie. Ogółem 120 próbek (12,9%) uzyskało wynik pozytywny. Pozytywne wyniki uzyskano w ciągu 30-40 minut i zgłoszono bezpośrednio do zespołów SDB [Faye O i in.].

ZBLIŻAĆ SIĘ

Cel:

Aby ocenić wydajność i charakterystykę operacyjną różnicowego RPA, użyjemy i) panelu dobrze scharakteryzowanych surowic EBOV z próbek pobranych w Gwinei i DRK ii) surowic z przypadków podejrzanych o EVD oraz iii) surowic z rutynowej diagnostyki w IPD i NIBR.

Badana populacja:

Badanie zostanie przeprowadzone na materiale pobranym od osób podejrzanych o EVD, archiwalnych i prospektywnych próbkach ujemnych EBOV oraz wybranych próbkach rutynowej diagnostyki.

Kryteria włączenia i wyłączenia: Wszyscy uczestnicy (mężczyźni, kobiety, dorośli i dzieci) spełniający definicję przypadku WHO „podejrzanego” i „prawdopodobnego” przypadku EVD, kwalifikujący się do testu RT-PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z obecnie stosowaną definicją przypadku w DRK. W przypadku oceny prospektywnej wymagana będzie świadoma ustna zgoda pacjenta/opiekuna prawnego w celu zakwalifikowania do udziału w badaniu, a kryteriami wykluczenia będą niemożność wyrażenia zgody, dostarczenie próbek lub stan, który mógłby zagrozić bezpieczeństwu uczestnika.

Wielkość próbki:

Panel 50-100 próbek RT-PCR dodatnich dla każdego różnicującego patogenu i 50-100 próbek RT-PCR ujemnych zostanie zebrany i wykorzystany. Przy oczekiwanej czułości i swoistości testu RPA na poziomie 98 % (przedział ufności 95 %) do badania należy włączyć co najmniej 30 przypadków dodatnich i ujemnych dla każdego parametru. Na podstawie naszych doświadczeń w Gwinei, 10% testów RT-PCR na próbkach z podejrzanych przypadków daje wynik pozytywny na EBOV. W związku z tym należy przebadać 300 podejrzanych przypadków EVD, aby uzyskać co najmniej 30 próbek dodatnich pod względem EVD. W pozostałych 270 próbkach należy spodziewać się gradientu rozpowszechnienia P. falciparum > S. typhi > DENV > YFV. Minimalna liczba wyników dodatnich i ujemnych, które należy przetestować dla każdego parametru, zostanie obliczona zgodnie z ich występowaniem.

Pobieranie i przetwarzanie próbek:

W prospektywnym badaniu z udziałem pacjentów z gorączką i potencjalnych nowych ognisk EVD ślina i surowica zostaną pobrane za pomocą wymazu z jamy ustnej i nakłucia żyły zgodnie z SOP przeprowadzonymi podczas epidemii EVD w Gwinei, zharmonizowanymi z SOP stosowanymi w DRK u pacjentów z objawami EVD spełniających wymagania protokołu kryteria. Zostanie przeprowadzona EBOV-RPA i RT-PCR w czasie rzeczywistym, a wyniki zostaną sklasyfikowane jako zgodne negatywne, pozytywne lub niezgodne. Pacjenci z ujemnymi i dodatnimi wynikami EBOV będą odpowiednio wypisywani lub hospitalizowani zgodnie z kryteriami ustalonymi lokalnie. Niezgodne wyniki zostaną ponownie przetestowane na tej samej próbce, a dodatkowa zostanie pobrana 24 godziny później. Jeśli rozbieżności nie można rozwiązać, wyniki zostaną omówione z klinicystą, aby podjąć najlepszą decyzję dla pacjenta i społeczności w kontekście. Zarchiwizowane próbki będą badane bezpośrednio z porcji przechowywanych w zamrażarce.

Protokół ekstrakcji próbki:

Początkowo wszystkie pobrane próbki zostaną poddane etapowi inaktywacji przy użyciu buforu do lizy w przenośnym pojemniku rękawicowym BSL-3 (Rysunek 2). Dwa protokoły szybkiej ekstrakcji zostaną zweryfikowane i porównane pod kątem ich przydatności do użytku w terenie, (i) protokół lizy alkalicznej oparty na NaoH dostarczony przez TwistDX, który może być stosowany bezpośrednio na pełnej krwi i surowicy [Osmundson TW i in.], (ii) metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych na bazie bibuły filtracyjnej umożliwiająca ekstrakcję całkowitego kwasu nukleinowego z surowych próbek [Zou Y i in.].

Oba protokoły wymagają maksymalnie 10 minut. Ekstrakty zostaną przesłane do laboratorium BSL-4 w Winnipeg w Kanadzie (NML) w celu potwierdzenia inaktywacji wirusa Ebola w ekstrakcie próbki poprzez inokulację hodowli komórkowej. RPA będzie działać z laboratorium walizkowego, które zawiera cały potrzebny sprzęt i odczynniki (Rysunek 1)

.

Gromadzenie i przechowywanie danych:

Dane kliniczne i wyniki zostaną zapisane za pomocą istniejącego kwestionariusza stosowanego w Gwinei, zharmonizowanego z procedurami w DRK i wprowadzone do bazy danych. Dane obejmują między innymi wiek, płeć, datę przyjęcia, datę wystąpienia, datę pobrania próbki, szczegółowe objawy, wyniki badań, ostateczną klasyfikację pacjenta, przebieg choroby.

Zostaną wdrożone odpowiednie środki kontroli jakości w celu monitorowania wiarygodności procesu gromadzenia danych, zgodności z ogólnym zarządzeniem wejścia oraz jakości generowanych danych. Na koniec badania wszystkie zebrane dane zostaną sprawdzone pod kątem jakości i zablokowane do analizy danych.

Standardowa procedura operacyjna:

Zostaną udostępnione standardowe procedury operacyjne wszystkich odpowiednich procesów badawczych.

Metody analizy danych:

Dane kliniczne zostaną przeanalizowane w celu uzyskania dokładnego opisu badanej populacji. Każda zebrana zmienna zostanie opisana za pomocą wskaźników statystycznych, takich jak średnia, mediana, odchylenie standardowe dla zmiennych ilościowych oraz częstości dla zmiennych jakościowych. Zapewnione zostaną 95% przedziały ufności, a także testy istotności (takie jak Xi-kwadrat) w celu porównania wydajności analitycznej i klinicznej testów diagnostycznych EVD.

Dokładność testu:

Pozytywny ref Negatywny wynik testów ref Wynik testów Pozytywny wynik testu TP FP

Negatywny wynik testu FN TN

Czułość: Odsetek próbek prawdziwie dodatnich. (TP/TP+FN) Specyficzność: Odsetek próbek prawdziwie ujemnych. (TN/TN+FP) Czułość i specyficzność zostaną połączone w wartość kappa w celu oszacowania ogólnej wydajności testów.

Przydatność testu:

Opracowany zostanie system punktacji do oceny przyjazności dla użytkownika