Mobile Point-of-Care-Diagnosetests für die Ebola-Viruserkrankung in der Demokratischen Republik Kongo (MobEboDRC)

Beim Ebola-Ausbruch in Guinea wurden bis zu 90 % der Patienten negativ getestet, aber selten auf Differenzialdiagnosen gestellt, und Malaria und andere Krankheiten wurden unterdiagnostiziert, was höchstwahrscheinlich zu mehr Todesfällen durch diese Infektionserreger führt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Angst der Patienten, an Ebola zu erkranken, während sie an einer anderen Krankheit leiden, überwunden werden muss, indem rechtzeitig die richtige Diagnose des Erregertyps gestellt wird. [Dunbar NK et al.].

Der RPA-Assay ist sechsmal schneller als herkömmliche Real-Time-PCR bei gleicher analytischer Sensitivität und Spezifität. Darüber hinaus macht das RPA-Format (Gerätegröße, kühlkettenunabhängige Reagenzien) schnelle Vor-Ort-Tests durchführbar und erschwinglich. Wir haben ein mobiles Labor entwickelt, das aus einer Hartplastik-Glovebox, einem Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS) und einem Solarpanel- und Netzteil-Set besteht. Die zerlegte Glovebox wird in einer Metallbox (80 × 60 × 41 cm) mit anderen notwendigen Materialien (Desinfektionslösung, Extraktionskits, Filterspitzen, Gestelle, Vortex, Wärmeblock, autoklavierbare Plastiktüten und persönliche Schutzausrüstung (PSA) aufbewahrt). Das Gesamtgewicht beträgt 28 kg für die Box und 16 kg für das DiaS. Probeninaktivierung und RNA-Extraktion mit dem SE-Kit wurden bisher in der Glovebox durchgeführt. Dies ermöglichte den Umgang mit Proben der Gefahrengruppe 4. Der RT-RPA-Assay wurde im DiaS mit dem ESEQuant TS2-Gerät mit integriertem Touchscreen durchgeführt, um das Gerät zu bedienen und die Ergebnisse anzuzeigen, ohne dass ein Laptop erforderlich ist, der nicht leicht zu desinfizieren ist (Abbildung 1). Das mobile Labor wurde erfolgreich eingesetzt in Conakry, als sich gegen Ende 2014 eine zunehmende Zahl von Fällen, vor allem aufgrund von Nichtmelden, Zurückhaltung und Infektionsübertragungsketten bei Bestattungen, entwickelte. Um schnelle Ergebnisse für das Programm für eine sichere und würdevolle Bestattung (SDB) zu liefern, wurden im Distrikt Matoto Gbessia Port II zwei mobile Labors eingerichtet. Insgesamt wurden 928 postmortale Abstrichproben getestet. Insgesamt wurden 120 Proben (12,9 %) positiv bewertet. Positive Ergebnisse wurden innerhalb von 30-40 min erhalten und direkt an die SDB-Teams gemeldet [Faye O et al.].

ANSATZ

Zielsetzung:

Zur Bewertung der Leistungen und Betriebseigenschaften des differentiellen RPA verwenden wir i) ein Panel gut charakterisierter EBOV-Seren aus Proben, die in Guinea und der Demokratischen Republik Kongo gesammelt wurden, ii) Seren von EVD-Verdachtsfällen und iii) Seren aus der Routinediagnostik bei IPD und NIBR.

Studienpopulation:

Die Studie wird an Material von EVD-verdächtigen Personen, archivierten und prospektiven EBOV-negativen Proben und ausgewählten routinediagnostischen Proben durchgeführt.

Einschluss- und Ausschlusskriterien: Alle Probanden (männlich, weiblich, Erwachsene und Kinder), die die WHO-Falldefinition von „verdächtigem“ und „wahrscheinlichem“ EVD-Fall erfüllen, sind für einen Echtzeit-RT-PCR-Test gemäß der derzeit verwendeten Falldefinition in der Demokratischen Republik Kongo geeignet. Für die prospektive Bewertung wird eine mündliche Einverständniserklärung des Patienten/Erziehungsberechtigten angefordert, um an der Studie teilnehmen zu können, und Ausschlusskriterien sind die Unfähigkeit, eine Einwilligung zu erteilen, Proben oder Bedingungen, die die Sicherheit des Probanden gefährden könnten.

Probengröße:

Ein Panel von 50–100 RT-PCR-positiven Proben für jeden differenziellen Krankheitserreger und 50–100 RT-PCR-negativen Proben wird zusammengestellt und verwendet. Bei einer erwarteten RPA-Assay-Sensitivität und -Spezifität von 98 % (Konfidenzintervall von 95 %) müssen mindestens 30 positive und negative Fälle für jeden Parameter in die Studie aufgenommen werden. Basierend auf unseren Erfahrungen in Guinea sind 10 % der RT-PCR-Tests an Proben von Verdachtsfällen EBOV-positiv. Folglich müssen 300 EVD-Verdachtsfälle gescreent werden, um mindestens 30 EVD-positive Proben zu erhalten. In den verbleibenden 270 Proben wäre ein Prävalenzgradient von P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV zu erwarten. Die Mindestanzahl der zu testenden positiven und negativen Ergebnisse für jeden Parameter wird entsprechend ihrer Prävalenz berechnet.

Probenentnahme und -verarbeitung:

Für die prospektive Studie bei fieberhaften Patienten und potenziellen neuen EVD-Ausbrüchen werden Speichel und Serum durch oralen Abstrich und Venenpunktion gemäß SOP gesammelt, die beim EVD-Ausbruch in Guinea durchgeführt wurden, harmonisiert mit SOPs, die in der Demokratischen Republik Kongo für Patienten mit EVD-Symptomen verwendet werden, die dem Aufnahmeprotokoll entsprechen Kriterien. EBOV-RPA und Echtzeit-RT-PCR werden durchgeführt und die Ergebnisse werden als übereinstimmend negativ oder positiv oder diskordant klassifiziert. Patienten mit negativen und positiven EBOV-Ergebnissen werden entsprechend den vor Ort festgelegten Kriterien entlassen oder ins Krankenhaus eingeliefert. Nicht übereinstimmende Ergebnisse werden mit derselben Probe erneut getestet und 24 Stunden später eine zusätzliche entnommen. Wenn die Diskrepanz nicht behoben werden kann, werden die Ergebnisse mit dem Arzt besprochen, um die beste Entscheidung für den Patienten und die Gemeinschaft in Bezug auf den Kontext zu treffen. Archivierte Proben werden direkt von im Gefrierschrank gelagerten Aliquots getestet.

Probenextraktionsprotokoll:

Zunächst werden alle gesammelten Proben einem Inaktivierungsschritt mit Lysepuffer in einer tragbaren BSL-3-Handschuhbox unterzogen (Abbildung 2). Zwei Schnellextraktionsprotokolle werden validiert und auf ihre Eignung für den Feldeinsatz verglichen, (i) ein von TwistDX bereitgestelltes NaoH-basiertes alkalisches Lyseprotokoll, das direkt auf Vollblut und Serum angewendet werden kann [Osmundson TW et al.], (ii) a Nukleinsäure-Extraktionsmethode auf Filterpapierbasis, die eine vollständige Nukleinsäure-Extraktion aus Rohproben ermöglicht [Zou Y et al.].

Beide Protokolle benötigen maximal 10 Minuten. Die Extrakte werden an das BSL-4-Labor in Winnipeg, Kanada (NML) gesendet, um die Inaktivierung des Ebola-Virus im Probenextrakt durch Inokulation auf die Zellkultur zu bestätigen. Die RPA wird vom Kofferlabor aus betrieben, das alle erforderlichen Geräte und Reagenzien enthält (Abbildung 1).

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Datenerhebung und -speicherung:

Klinische Daten und Ergebnisse werden über einen bestehenden, in Guinea verwendeten Fragebogen erfasst, mit den Verfahren in der Demokratischen Republik Kongo harmonisiert und in eine Datenbank eingegeben. Zu den Daten gehören unter anderem Alter, Geschlecht, Aufnahmedatum, Datum des Beginns, Datum der Probenahme, detaillierte Symptome, Testergebnisse, endgültige Klassifizierung des Patienten, Krankheitsverlauf.

Es werden geeignete Qualitätskontrollmaßnahmen implementiert, um die Zuverlässigkeit des Prozesses für die Datenerfassung, die Einhaltung der allgemeinen Eingangsverwaltung und die Qualität der generierten Daten zu überwachen. Am Ende der Studie werden alle gesammelten Daten auf Qualität kontrolliert und für die Datenanalyse gesperrt.

Standardverfahren:

SOPs aller anwendbaren Forschungsprozesse werden zur Verfügung gestellt.

Methoden der Datenanalyse:

Klinische Daten werden analysiert, um eine genaue Beschreibung der Studienpopulation zu geben. Jede erfasste Variable wird mit statistischen Indikatoren wie Mittelwert, Median, Standardabweichung für quantitative Variablen und Häufigkeiten für qualitative Variablen beschrieben. Die 95-%-Konfidenzintervalle werden ebenso bereitgestellt wie Signifikanztests (z. B. Xi-Quadrat) zum Vergleich zwischen analytischer und klinischer Leistung der EVD-Diagnosetests.

Testgenauigkeit:

Positiver Hinweis Negativer Hinweis Testergebnis Testergebnis Positives Testergebnis TP FP

Negatives Testergebnis FN TN

Sensitivität: Anteil richtig positiver Proben. (TP/TP+FN) Spezifität: Anteil richtig negativer Proben. (TN/TN+FP) Die Sensitivität und die Spezifität werden in einem Kappa-Wert kombiniert, um die Gesamtleistung der Tests abzuschätzen.

Nützlichkeit testen:

Zur Bewertung der Benutzerfreundlichkeit wird ein Scoring-System entwickelt