Pruebas de diagnóstico en el punto de atención móvil para la enfermedad por el virus del Ébola en la República Democrática del Congo (MobEboDRC)

En el brote de ébola en Guinea, hasta el 90 % de los pacientes dieron negativo, pero rara vez se les diagnosticó diferenciales, y la malaria y otras enfermedades no se diagnosticaron correctamente, lo que probablemente provoque más muertes por estos agentes infecciosos. Otro aspecto importante es que, el temor de los pacientes de tener Ébola, mientras padecen otra enfermedad, debe superarse proporcionando el diagnóstico correcto del tipo de patógeno a tiempo. [Dunbar NK et al.].

El ensayo RPA es seis veces más rápido que la PCR en tiempo real convencional y ofrece la misma sensibilidad y especificidad analíticas. Además, el formato RPA (tamaño del equipo, reactivos independientes de la cadena de frío) hace que las pruebas rápidas in situ sean factibles y asequibles. Desarrollamos un laboratorio móvil, que consiste en una guantera de plástico duro, un Diagnóstico en una maleta (DiaS) y un panel solar y un paquete de energía. La guantera desmontada se guarda en una caja metálica (80 × 60 × 41 cm) con otros materiales necesarios (solución desinfectante, kits de extracción, puntas de filtro, rejillas, vortex, bloque térmico, bolsas de plástico esterilizables en autoclave y equipo de protección personal (EPI). El peso total es de 28 kg para la caja y 16 kg para el DiaS. La inactivación de muestras y la extracción de ARN utilizando el kit SE hasta ahora se realizaron en la guantera. Esto permitió la manipulación de muestras del grupo de riesgo 4. El ensayo RT-RPA se realizó en el DiaS que contenía el dispositivo ESEQuant TS2 con pantalla táctil integrada para operar el dispositivo y mostrar los resultados sin necesidad de una computadora portátil, que no es fácil de desinfectar (Figura 1). El laboratorio móvil se implementó con éxito en Conakry, cuando a fines de 2014 se desarrolló un número creciente de casos, debido principalmente a la falta de notificación, la reticencia y las cadenas de transmisión de infecciones durante los entierros. Para proporcionar resultados rápidos para el programa de entierro seguro y digno (SDB), se instalaron dos laboratorios móviles en el distrito de Matoto Gbessia Port II. En total, se analizaron 928 muestras de hisopos post-mortem. En total, 120 muestras (12,9 %) dieron positivo. Los resultados positivos se obtuvieron en 30-40 minutos y se informaron directamente a los equipos de SDB [Faye O et al.].

ACERCARSE

Objetivo:

Para evaluar el rendimiento y las características operativas del RPA diferencial, utilizaremos i) un panel de sueros EBOV bien caracterizados de muestras recolectadas en Guinea y la República Democrática del Congo, ii) sueros de casos sospechosos de EVE, y iii) sueros de diagnósticos de rutina en IPD y NIBR.

Población de estudio:

El estudio se llevará a cabo con material de personas sospechosas de EVE, muestras negativas archivadas y prospectivas de EBOV y muestras seleccionadas de diagnóstico de rutina.

Criterios de inclusión y exclusión: Todos los sujetos (hombres, mujeres, adultos y niños) que cumplan con la definición de caso de la OMS de caso "sospechoso" y "probable" de EVE elegibles para el ensayo de RT-PCR en tiempo real, de acuerdo con la definición de caso utilizada actualmente en la República Democrática del Congo. Para la evaluación prospectiva, se solicitará el consentimiento informado oral del paciente/tutor legal para la elegibilidad para participar en el estudio y los criterios de exclusión serán la imposibilidad de proporcionar el consentimiento, las muestras o la condición que pueda poner en peligro la seguridad del sujeto.

Tamaño de la muestra:

Se ensamblará y utilizará un panel de 50-100 muestras positivas de RT-PCR para cada patógeno diferencial y 50-100 muestras negativas de RT-PCR. Con una sensibilidad y especificidad esperadas del ensayo RPA del 98 % (intervalo de confianza del 95 %), se incluirán en el estudio un mínimo de 30 casos positivos y negativos para cada parámetro. Según nuestra experiencia en Guinea, el 10% de las pruebas de RT-PCR en muestras de casos sospechosos son positivas para EBOV. En consecuencia, se deben examinar 300 casos sospechosos de EVE para obtener al menos 30 muestras positivas de EVE. Se esperaría un gradiente de prevalencia de P. falciparum > S. typhi > DENV > YFV en las 270 muestras restantes. El número mínimo de positivos y negativos a ensayar para cada parámetro se calculará en función de su prevalencia.

Toma y procesamiento de muestras:

Para el estudio prospectivo en pacientes febriles y posibles nuevos brotes de EVE, la saliva y el suero se recolectarán mediante hisopado oral y venopunción según el SOP realizado en el brote de EVE en Guinea armonizado con los SOP utilizados en la República Democrática del Congo para pacientes con síntomas de EVE que cumplan con la inclusión del protocolo. criterios. Se realizarán EBOV-RPA y RT-PCR en tiempo real y los resultados se clasificarán como concordantes negativos, positivos o discordantes. Los pacientes con resultados negativos y positivos para EBOV serán dados de alta u hospitalizados, respectivamente, de acuerdo con los criterios establecidos localmente. Los resultados discordantes se volverán a analizar en la misma muestra y se recolectará una adicional 24 horas después. Si no se puede resolver la discrepancia, los resultados se discutirán con el médico para tomar la mejor decisión para el paciente y las comunidades con respecto al contexto. Las muestras archivadas se analizarán directamente a partir de alícuotas almacenadas en el congelador.

Protocolo de extracción de muestras:

Inicialmente, todas las muestras recolectadas se someterán a un paso de inactivación utilizando un tampón de lisis en una guantera portátil BSL-3 (Figura 2). Se validarán y compararán dos protocolos de extracción rápida en cuanto a su idoneidad para el uso en el campo, (i) un protocolo de lisis alcalina basado en NaoH proporcionado por TwistDX que se puede usar directamente en sangre entera y suero [Osmundson TW et al.], (ii) un método de extracción de ácido nucleico basado en papel de filtro que permite la extracción total de ácido nucleico de muestras crudas [Zou Y et al.].

Ambos protocolos requieren un máximo de 10 minutos. Los extractos se enviarán al laboratorio BSL-4 en Winnipeg, Canadá (NML), para confirmar la inactivación del virus del Ébola en el extracto de muestra mediante la inoculación en cultivo celular. El RPA será operado desde la maleta de laboratorio, que contiene todos los equipos y reactivos necesarios (Figura 1)

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Recopilación y almacenamiento de datos:

Los datos clínicos y los resultados se registrarán a través de un cuestionario existente que se utiliza en Guinea, se armonizará con los procedimientos de la República Democrática del Congo y se ingresará en una base de datos. Los datos incluyen, entre otros, edad, sexo, fecha de ingreso, fecha de inicio, fecha de muestreo, síntomas detallados, resultados de las pruebas, clasificación final del paciente, resultado de la enfermedad.

Se implementarán medidas de control de calidad apropiadas para monitorear la confiabilidad del proceso para la recopilación de datos, el cumplimiento de la gestión general de entrada y la calidad de los datos generados. Al final del estudio, se controlará la calidad de todos los datos recopilados y se bloquearán para el análisis de datos.

Procedimiento Operativo Estándar:

Los SOP de todos los procesos de investigación aplicables estarán disponibles.

Métodos de análisis de datos:

Los datos clínicos se analizarán para dar una descripción precisa de la población de estudio. Cada variable recolectada se describirá utilizando indicadores estadísticos como media, mediana, desviación estándar para variables cuantitativas y frecuencias para variables cualitativas. Se proporcionarán los intervalos de confianza del 95 %, así como las pruebas de significancia (como Xi-cuadrado) para comparar el rendimiento analítico y clínico de las pruebas de diagnóstico de la EVE.

Exactitud de la prueba:

Ref. positiva Ref. negativa resultado de las pruebas resultado de las pruebas Resultado de la prueba positivo TP FP

Resultado de prueba negativo FN TN

Sensibilidad: Proporción de muestras positivas verdaderas. (TP/TP+FN) Especificidad: Proporción de muestras negativas verdaderas. (TN/TN+FP) La sensibilidad y la especificidad se combinarán en un valor kappa para estimar el rendimiento general de las pruebas.

Prueba de utilidad:

Se desarrollará un sistema de puntuación para evaluar la facilidad de uso