Mobile Point of Care Diagnostisk testing for ebolavirussykdom i DRC (MobEboDRC)

I ebola-utbruddet i Guinea testet opptil 90 % av pasientene negative, men ble sjelden diagnostisert for forskjeller, og malaria og andre sykdommer ble underdiagnostisert, noe som mest sannsynlig førte til flere dødsfall fra disse smittestoffene. Et annet viktig aspekt er at frykten til pasientene for å ha ebola, mens de lider av annen sykdom, må overvinnes ved å gi riktig diagnose av typen patogen i tide. [Dunbar NK et al.].

RPA-analysen er seks ganger raskere enn konvensjonell sanntids-PCR, samtidig som den gir samme analytiske sensitivitet og spesifisitet. I tillegg gjør RPA-formatet (utstyrsstørrelse, kaldkjede-uavhengige reagenser) rask testing på stedet mulig og rimelig. Vi utviklet et mobilt laboratorium, som består av et hanskerom i hardplast, en Diagnostics-in-a-Suitcase (DiaS), og et solcellepanel og strømpakkesett. Det demonterte hanskerommet oppbevares i en metallboks (80 × 60 × 41 cm) med andre nødvendige materialer (desinfeksjonsløsning, ekstraksjonssett, filterspisser, stativer, vortex, varmeblokk, autoklaverbare plastposer og personlig verneutstyr (PPE). Totalvekten er 28 kg for boksen og 16 kg for DiaS. Prøveinaktivering og RNA-ekstraksjon ved bruk av SE-settet så langt ble gjort i hanskerommet. Dette tillot håndtering av faregruppe 4 prøver. RT-RPA-analysen ble utført i DiaS som inneholdt ESEQuant TS2-enheten med integrert berøringsskjerm for å betjene enheten og vise resultatene uten behov for en bærbar datamaskin, som ikke er lett å desinfisere (Figur 1). Den mobile laboratoriet ble implementert med suksess. i Conakry da et økende antall tilfeller, hovedsakelig på grunn av manglende rapportering, tilbakeholdenhet og smitteoverføringskjeder under begravelser utviklet seg mot slutten av 2014. For å gi raske resultater for programmet for sikker og verdig begravelse (SDB) ble det satt opp to mobile laboratorier i Matoto Gbessia Port II-distriktet. Til sammen 928 post mortem vattpinneprøver ble testet. Totalt sett var 120 prøver (12,9 %) positive. Positive resultater ble oppnådd innen 30-40 minutter og rapportert direkte til SDB-teamene [Faye O et al.].

NÆRME SEG

Objektiv:

For å vurdere ytelsen og operasjonelle egenskaper til den differensielle RPA vil vi bruke i) et panel av godt karakteriserte EBOV-sera fra prøver samlet i Guinea og DRC ii) sera fra EVD-mistenkte tilfeller, og iii) sera fra rutinediagnostikk ved IPD og NIBR.

Studiepopulasjon:

Studien vil bli utført på materiale fra EVD-mistenkte personer, arkiverte og prospektive EBOV-negative prøver og utvalgte rutinediagnostiske prøver.

Inklusjons- og eksklusjonskriterier: Alle forsøkspersoner (mann, kvinne, voksne og barn) som oppfyller WHOs saksdefinisjon av "mistenkt" og "sannsynlig" EVD-tilfelle kvalifisert for sanntids RT-PCR-analyse, i henhold til den gjeldende tilfelledefinisjonen i DRC. For den prospektive evalueringen vil det bli bedt om muntlig informert samtykke fra pasienten/vergen for å være kvalifisert til å delta i studien, og eksklusjonskriterier vil være manglende evne til å gi samtykke, prøver eller tilstand som kan sette forsøkspersonens sikkerhet i fare.

Eksempelstørrelse:

Et panel med 50-100 RT-PCR-positive prøver for hvert differensialpatogen og 50-100 RT-PCR-negative prøver vil bli satt sammen og brukt. Med en forventet RPA-analysesensitivitet og spesifisitet på 98 % (konfidensintervall på 95 %), skal minimum 30 positive og negative tilfeller for hver parameter inkluderes i studien. Basert på vår erfaring i Guinea, er 10 % av RT-PCR-tester på prøver fra mistenkte tilfeller EBOV-positive. Følgelig må 300 mistenkte EVD-tilfeller screenes for å få minst 30 EVD-positive prøver. En prevalensgradient av P. falciparum > S.typhi > DENV > YFV kan forventes i de resterende 270 prøvene. Minimum antall positive og negative som skal testes for hver parameter vil bli beregnet i henhold til deres prevalens.

Prøveinnsamling og behandling:

For den prospektive studien i febrile pasienter og potensielle nye EVD-utbrudd, vil spytt og serum bli samlet inn via oral vattpinne og venepunktur i henhold til SOP utført i EVD-utbruddet i Guinea harmonisert med SOP-er brukt i DRC for pasienter med EVD-symptomer som overholder protokollen. kriterier. EBOV-RPA og sanntids RT-PCR vil bli utført og resultatene vil bli klassifisert som konkordant negative eller positive eller disharmoniske. Pasienter med EBOV negative og positive resultater vil henholdsvis bli utskrevet eller innlagt på sykehus i henhold til lokalt fastsatte kriterier. Uoverensstemmende resultater vil bli testet på nytt på den samme prøven og en supplerende en samlet inn 24 timer senere. Hvis avvik ikke kan løses, vil resultatene bli diskutert med klinikeren for å ta den beste avgjørelsen for pasienten og lokalsamfunnet angående konteksten. Arkiverte prøver vil bli testet direkte fra alikvoter lagret i fryseren.

Prøveekstraksjonsprotokoll:

Til å begynne med vil all innsamlet prøve bli utsatt for inaktiveringstrinn ved bruk av lyseringsbuffer i BSL-3 bærbar hanskeboks (Figur 2). To hurtigekstraksjonsprotokoller vil bli validert og sammenlignet for deres egnethet for feltbruk, (i) en NaoH-basert alkalisk lyseringsprotokoll levert av TwistDX som kan brukes direkte på fullblod og serum [Osmundson TW et al.], (ii) en filterpapirbasert nukleinsyreekstraksjonsmetode som tillater total nukleinsyreekstraksjon fra råprøver [Zou Y et al.].

Begge protokollene krever maksimalt 10 minutter. Ekstrakter vil bli sendt til BSL-4-laboratoriet i Winnipeg, Canada (NML), for å bekrefte inaktivering av ebola-virus i prøveekstraktet ved inokulering på cellekultur. RPA vil bli betjent fra koffertlaboratoriet, som inneholder alt utstyr og reagenser som trengs (Figur 1)

.

Datainnsamling og lagring:

Kliniske data og resultater vil bli registrert via et eksisterende spørreskjema brukt i Guinea, harmonisert til prosedyrer i DRC og lagt inn i en database. Data inkluderer, men er ikke begrenset til, alder, kjønn, dato for innleggelse, dato for debut, dato for prøvetaking, detaljerte symptomer, resultater av testing, endelig klassifisering av pasienten, sykdomsutfall.

Hensiktsmessige kvalitetskontrolltiltak vil bli implementert for å overvåke påliteligheten til prosessen for datainnsamling, innføring av generell ledelsesoverholdelse og for kvaliteten på data generert. På slutten av studien vil all data som samles inn, bli kontrollert for kvalitet og låst for dataanalyse.

Standard operasjons prosedyre:

SOP-er for alle gjeldende forskningsprosesser vil bli gjort tilgjengelig.

Dataanalysemetoder:

Kliniske data vil bli analysert for å gi en nøyaktig beskrivelse av studiepopulasjonen. Hver innsamlet variabel vil bli beskrevet ved hjelp av statistiske indikatorer som gjennomsnitt, median, standardavvik for kvantitative variabler og frekvenser for kvalitative variabler. 95 % konfidensintervaller vil bli gitt samt signifikanstester (som Xi-square) for sammenligning mellom analytisk og klinisk ytelse av EVD-diagnostiske tester.

Testnøyaktighet:

Positiv ref Negativ ref-tester resultat testresultat Positivt testresultat TP FP

Negativt testresultat FN TN

Sensitivitet: Andel sanne positive prøver. (TP/TP+FN) Spesifisitet: Andel ekte negative prøver. (TN/TN+FP) Sensitiviteten og spesifisiteten vil bli kombinert i en kappa-verdi for å estimere den totale ytelsen til testene.

Testnytte:

Det skal utvikles et skåringssystem for å vurdere brukervennligheten