COVID-19 患者の唾液中のウイルス量を減らすための防腐性洗口剤 (BUCOSARS)

唾液中のウイルス量を減らす戦略は、SARS-CoV-2 の伝染のリスクを減らすことに貢献する可能性があります。 したがって、殺ウイルス活性を持つ防腐剤を含むうがい薬の使用は、一般集団に容易に適用できる単純で低コストの予防戦略となり得る. 唾液サンプル中の in vivo での SARS-CoV-2 ウイルス負荷を中和または減少させるいくつかの消毒薬の効果を評価するために、多施設、無作為化、盲検、5 並列群、プラセボ対照試験が設計されました。

この研究は、スペインのマドリッド、バレンシア、ムルシア地域の 5 つの異なる病院で実施されます。フンダシオン ヒメネス ディアス大学病院 (スペイン、マドリッド)、ビジャルバ大学総合病院 (スペイン、マドリッド)、インファンタ エレナ大学病院 (スペイン、マドリッド)。 、Virgen de la Arixaca 大学病院 (ムルシア、スペイン) および Clínico de Valencia 大学病院 (バレンシア、スペイン)。

含まれるすべての患者は、SARS-COV-2感染のために以前に診断され、入院しており、主に呼吸器の病理のために入院しています。 それらのすべては成人 (年齢 > 18 歳) であり、病院の倫理委員会の勧告に従って、参加に対して自発的な書面または口頭の同意を提供します。

同意の承認後、介入を担当する病院スタッフは、以前にランダムに生成されたテーブルからの順序に従って、各参加者にコードを連続的に割り当てます。 コードは、患者番号と 5 つの研究グループ (A、B、C、D、および E) のいずれかに対応する文字で構成され、臨床担当者には知られていますが、サンプルを処理する検査室の担当者には知られていません。 RNAを抽出するだけでなく、データを分析するものにも。 このようにして、参加者は 5 つの治​​療グループのいずれかにランダムに割り当てられ、うがい薬とプラセボの両方に同じ容量の同一のチューブを使用することでブラインドが達成されます。

対象となるすべての患者は、サンプル採取の 1 時間前から、飲食、水以外の飲み物、ガムを噛む、喫煙する、歯を磨く、またはマウスウォッシュを使用しないように求められます。 さらに、マウスウォッシュ後 30 分間は飲酒が禁止されており、試験中は食事が禁止されています。

5 種類のマウスウォッシュが無作為化されています: 2% ポビドンヨード (グループ A)、1% 過酸化水素 (グループ B)、0.12% クロルヘキシジン (グループ C)、0.07% 塩化セチルピリジニウム (グループ D)、および蒸留水 (グループ E)。対照群。 グループ C (Clorhexidina Dental PHB©) および D (Vitis Xtra Forte©) リンスは、市販のフォーミュラですぐに使用できます。 うがい薬 A および B の場合、市販の調合乳をすすぐ数分前に蒸留水で希釈することにより、濃度を前述の値に調整する必要があります (3 mL の経口用ポビドンヨード 10% を 12 mL の蒸留水で希釈し、グループ A; 5 mL の過酸化水素 3%-Oximen© と 10 mL の蒸留水、グループ B)。 すべてのうがい薬とそれぞれの希釈液は、安全と分類された市販品です。

合計 4 つの刺激されていない唾液サンプルを患者ごとに収集します。それぞれ 30 分、60 分、および 120 分で、1 つは基礎、3 つはマウスウォッシュ後です。 患者は、気管支由来の分泌物がこぼれないように、よだれを垂らすことによって、刺激されていない各唾液サンプルを直径 10 cm の無菌プラスチック容器 (サンプル 0.5 mL 以上) に提供するように求められます。 各サンプリングの直後に、0.5 mL の唾液を滅菌エッペンドルフ チューブに移し、1.5 mL のウイルス不活化バッファーを患者コードとサンプル時間でラベル付けし、4 °C に保ちます。 患者ごとに 4 本のエッペンドルフ チューブが気密バッグに入れられ、望ましくない開口部や破損に備えて保護吸収材が入っています。 二次容器は、UN3733 規格に従って堅い箱に入れられ、分析のために宅配便で実験室に送られます。

ウイルス不活化バッファーで 1:3 の比率で希釈した各唾液サンプル 1 ml のアリコートを、標準的な TRIzol ベースの方法を使用した RNA 抽出に使用します。 簡単に説明すると、TRIzol 3 ml とクロロホルム 600 ul を加え、15 秒間激しくボルテックスし、氷上で 10 分間インキュベートします。 次に、サンプルを 12,000 g で 15 分間、4 °C で遠心分離し、水相を 750 ul のイソプロパノールを含む 2 つのきれいなマイクロチューブに移します。 チューブを反転させて混合し、15 分間インキュベートしてから、12,000 g で 10 分間、4 °C で遠心分離します。 デカンテーションによって上清を捨て、ペレットを 1 ml の 80% 冷エタノールで洗浄し、ボルテックスして完全に混合し、7,500 g で 5 分間、4 °C で遠心分離します。 上清を注意深く吸引して廃棄し、ペレットを室温で 10 分間乾燥させた後、15 ul の RNAse フリー水に再懸濁し、1 本のチューブにプールします。

メーカーの説明書に従って、Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen-12574026) を含む SuperScript™ III One-Step RT-PCR System を使用して、1 ステップ rRT-PCR を実行します。 SARSCoV-2 E (ベータコロナウイルススクリーニングアッセイ) 遺伝子の増幅のために、LightCycler 480 2.0 (Roche) プラットフォームで Charité-Berlin プロトコルに従って PCR を実行します。 同じ実行で、標本の品質を評価するために、ハウスキーピング ヒト遺伝子 RNP (リボヌクレアーゼ P) プライマーを使用してサンプルを増幅します。 すべてのサンプルは、以前に知られている陽性および陰性コントロールと共に、2 つの複製で実行されます。 ウイルスのコピーは、以前に生成された RNA 転写産物の 10 倍希釈標準曲線を使用して定量化されます (EDX SARS-CoV-2 標準、EXACT DIAGNOSTICS EDX)。 ウイルスのコピーは、ml の唾液によって正規化されました。

実施される分析に関して、この研究の主な目的は、in vivoで試験された唾液中のSARS-Cov2ウイルス量に対するさまざまなマウスウォッシュの効果を判断することです。 したがって、主要な結果は、各治療におけるベースラインとマウスウォッシュ後の 3 つの時点の間の唾液中のウイルス量の変化です。 さらに、すすぎ前の基礎ウイルス量と、年齢、性別、症状出現からの日数、鼻咽頭サンプルのPCRによって決定された患者のウイルス陽性からの日数など、収集されたさまざまな臨床データとの相関関係も研究されます。 . 最後に、カテゴリ別の臨床変数と、異なる治療法で異なる時期にウイルス量が改善する患者の頻度との間の可能な関連性が評価されます。

各ボランティアが独自のコントロールとして行動することを考慮して、マウスウォッシュでのすすぎ前のレベルに関して毎回唾液中のウイルス量の値を比較すると、ブランチごとに15人の患者のサンプルサイズが、有意なウイルス量の違いを特定するのに十分であると考えられました放棄または低いウイルス負荷による患者の損失が 10% であると仮定し、0.05 のアルファと 0.8 の検出力を採用すると、時点間で 20% を超える。 試験では 5 つのブランチ (ポビドンヨード、過酸化水素、クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム、および対照) がプログラムされていたため、75 人の患者が、さまざまな病院に分散される募集対象の合計個人の最小数でした。

ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用して、対応のあるケース (同じ個人の異なる時点での観測値を比較する場合) と、対応のないケース (異なる処理の相対的な変化に基づいて異なる処理を比較する場合) の両方の平均差をテストします。ウイルス量）。 さらに、Spearman の相関係数を使用してペアのサンプル間の関連性を調べるいくつかのテストが実行され、ウイルス量と他の臨床的連続変数との関係が評価されます。 最後に、臨床カテゴリ変数と治療に対する応答者/非応答者の頻度との関連を評価するために、研究者はカイ二乗分割表検定を実行します。 研究者は、基礎ウイルス量の 90% 以上の改善を示す個人をレスポンダーと定義しています。 すべての計算とテストは、統計計算用の R 環境バージョン 3.6.3 を使用して実行されます。 およびその「統計」パッケージ [R Core Team 2020]。

さらに、唾液中のウイルスの生存率に対するうがい薬の効果を判断するために、病院の倫理委員会に補遺が提出され、その承認後、さらに62人の患者が研究のために募集されました. この場合、プロトコルにはいくつかの変更が含まれていました。 (ii) ウイルスの生存率を確保するためにウイルス不活化バッファーを使用しない。 (iii) 追加の結果として含まれている唾液ウイルス (感染性ウイルス負荷) の感染能力を決定するための in vitro 感染アッセイ。 詳細は後述します。

この研究は、スペインのマドリッド、バレンシア、ムルシア地域の 4 つの異なる病院で実施されます。フンダシオン ヒメネス ディアス大学病院 (スペイン、マドリッド)、ビジャルバ大学総合病院 (スペイン、マドリッド)、インファンタ エレナ大学病院 (スペイン、マドリッド)。およびVirgen de la Arixaca大学病院（ムルシア、スペイン）。

合計 3 つの刺激されていない唾液サンプルを患者ごとに収集します。それぞれ 30 分と 60 分で、1 つは基礎、2 つはマウスウォッシュ後です。 患者は、気管支由来の分泌物がこぼれないように、よだれを垂らすことによって、刺激されていない各唾液サンプルを直径 10 cm の無菌のプラスチック容器 (サンプルの少なくとも 2 mL) に提供するように求められます。 3 つのサンプルは、実験室に送られるまで気密バッグに入れ、-80ºC で直ちに保管されます。 サンプル分析のために、各患者の 3 つの唾液サンプルが入った気密バッグのすべての二次容器は、UN3733 規格に従ってドライアイスの入った硬い箱に入れられ、宅配便で検査室 (FISABIO) に送られます。

FISABIO財団でサンプルを受け取ると、レベル3セキュリティ研究所の施設で次のように処理されます。 サンプルを室温で解凍した後、ＲＮＡ抽出のために２００μＬのアリコートを採取し、残りを等分し、細胞系でのアッセイのために直ちに−８０℃で保存する。

RNA 抽出は、唾液サンプルの製造元の指示に従って、完全に自動化されたプラットフォーム eMAG (bioMérieux、フランス) を使用して実行されます。 ワンステップ rRT-PCR および SARSCoV-2 の増幅は、上記のように実行されます。

細胞培養の場合、Vero-E6 細胞 (ATCC) は、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)、1% 非必須アミノ酸を添加した DMEM で培養されます。 % L-グルタミンおよび 25 mM HEPES。 すべての細胞を 37°C、5% CO2 でインキュベートします。

唾液サンプルは、1X ダルベッコの PBS で 1:1 に希釈されます。 希釈した唾液サンプル 300 ul を、24 ウェルプレートで 1.5 x 105 の Vero-E6 細胞とともに 37°C、5% CO2 で 1 時間インキュベートします。 結合していないウイルスを抽出し、培地を 500 ul の感染培地 (2% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)、1% 非必須アミノ酸、1% L-グルタミン、25mM HEPES およびトリプシン TPCK 6ug/ml)。 感染した Vero-E6 細胞を 37°C、5% CO2 でインキュベートします。 感染の5日後、eMAGプラットフォームの指示に従ってRNA抽出のために上清を収集し、SARSCoV-2の増幅のために1ステップのrRT-PCRを実行します。 この 5 日間の感染期間後に得られたウイルス負荷は、感染性ウイルス負荷と見なされます。