Enjuagues bucales antisépticos para reducir la carga viral salival en pacientes con COVID-19 (BUCOSARS)

Las estrategias de reducción de la carga viral salival podrían contribuir a reducir el riesgo de transmisión del SARS-CoV-2. Así, el uso de colutorios con antisépticos que tengan actividad virucida puede ser una estrategia preventiva sencilla y de bajo coste que podría aplicarse fácilmente en la población general. Para evaluar el efecto de varios antisépticos para neutralizar o reducir la carga viral de SARS-CoV-2 in vivo en muestras de saliva, se ha diseñado un ensayo multicéntrico, aleatorizado, ciego, de cinco grupos paralelos y controlado con placebo.

El estudio se llevará a cabo en las regiones de Madrid, Valencia y Murcia en España, en cinco hospitales diferentes: Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz (Madrid, España), Hospital General Universitario de Villalba (Madrid, España), Hospital Universitario Infanta Elena (Madrid, España) , Hospital Universitario Virgen de la Arixaca (Murcia, España) y Hospital Universitario Clínico de Valencia (Valencia, España).

Todos los pacientes incluidos están previamente diagnosticados y hospitalizados por infección por SARS-COV-2, ingresando principalmente por patología respiratoria. Todos ellos serán adultos (mayores de 18 años) y darán su consentimiento voluntario por escrito u oral para participar de acuerdo con las recomendaciones del comité de ética del hospital.

Tras la aprobación del consentimiento, el personal del hospital responsable de las intervenciones asignará consecutivamente a cada participante un código siguiendo el orden de una tabla previamente generada aleatoriamente. El código estará compuesto por un número de paciente y una letra correspondiente a uno de los cinco grupos de estudio (A, B, C, D y E), que será conocido por el personal clínico pero desconocido por el personal de laboratorio que procesará muestras y extraer el ARN, así como a los que analizarán los datos. De esta forma, los participantes serán asignados aleatoriamente a uno de los cinco grupos de tratamiento y el ciego se logrará utilizando tubos idénticos con el mismo volumen tanto para los enjuagues bucales como para el placebo.

A cada paciente incluido se le pide que no coma, beba nada más que agua, mastique chicle, fume, se cepille los dientes o use enjuague bucal durante una hora antes de la recolección de la muestra. Además, no se les permite beber durante media hora después del enjuague bucal y comer durante toda la prueba.

Se aleatorizan cinco colutorios: povidona yodada al 2% (grupo A), agua oxigenada al 1% (grupo B), clorhexidina al 0,12% (grupo C), cloruro de cetilpiridinio al 0,07% (grupo D) y agua destilada (grupo E), como grupo de control. Los enjuagues del grupo C (Clorhexidina dental PHB©) y D (Vitis Xtra Forte©) están listos para usar en sus fórmulas comerciales. En el caso de los colutorios A y B, las concentraciones deben ajustarse a las indicadas previamente diluyendo las fórmulas comerciales con agua destilada minutos antes del enjuague (3 mL de povidona yodada al 10% para uso oral con 12 mL de agua destilada, en grupo A; y 5 mL de agua oxigenada al 3%- Oximen© con 10 mL de agua destilada, en el grupo B). Todos los enjuagues bucales y sus respectivas diluciones son productos comerciales clasificados como seguros.

Se recogerán un total de 4 muestras de saliva no estimulada por cada paciente: una basal y tres tras el enjuague, a los 30 minutos, a los 60 minutos ya los 120 minutos, respectivamente. Se solicitará a los pacientes que aporten cada muestra de saliva no estimulada en un recipiente de plástico estéril de 10 cm de diámetro (al menos 0,5 mL de muestra) mediante babeo, evitando derramar secreciones de origen bronquial. Inmediatamente después de cada muestreo, se transferirán 0,5 mL de saliva a un tubo Eppendorf estéril con 1,5 mL de tampón inactivador de virus etiquetado con el código del paciente y el tiempo de la muestra y se mantendrá a 4 °C. Los cuatro tubos Eppendorf por paciente se introducirán en una bolsa hermética, conteniendo material absorbente protector en caso de apertura o rotura no deseada. Los contenedores secundarios se introducirán en una caja rígida según normas UN3733 y se enviarán al laboratorio por servicio de mensajería para su análisis.

Una alícuota de 1 ml de cada muestra de saliva diluida en el tampón inactivador de virus en proporción 1:3, se utilizará para la extracción de ARN mediante un método estándar basado en TRIzol. Brevemente, se añadirán 3 ml de TRIzol y 600 ul de cloroformo, se agitará enérgicamente durante 15 segundos y se incubará en hielo durante 10 minutos. Luego, las muestras se centrifugarán a 12.000 g durante 15 min a 4 °C y la fase acuosa se transferirá a dos microtubos limpios con 750 ul de isopropanol. Los tubos se mezclarán por inversión y se incubarán durante 15 minutos antes de la centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se desechará por decantación y los sedimentos se lavarán con 1 ml de etanol frío al 80 %, se agitarán en vórtex para mezclar bien y se centrifugarán a 7500 g durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se aspirarán y desecharán con cuidado, y los sedimentos se secarán a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de resuspenderse en 15 ul de agua libre de ARNasa y agruparse en un solo tubo.

La rRT-PCR de un paso se realizará utilizando el sistema SuperScript™ III One-Step RT-PCR con Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen-12574026) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la amplificación del gen SARSCoV-2 E (ensayo de detección de betacoronavirus), se realizará PCR siguiendo el protocolo Charité-Berlin en una plataforma LightCycler 480 2.0 (Roche). En la misma serie, las muestras se amplificarán con cebadores RNP (ribonucleasa P) de gen humano doméstico para evaluar la calidad de la muestra. Todas las muestras se analizarán en dos réplicas, junto con controles positivos y negativos previamente conocidos. Las copias de virus se cuantificarán utilizando una curva estándar de dilución de 10 veces de transcritos de ARN generados previamente (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Las copias del virus se normalizaron por ml de saliva.

En cuanto a los análisis a realizar, el objetivo principal del estudio es determinar el efecto de los diferentes enjuagues bucales sobre la carga viral SARS-Cov2 en saliva testada in vivo. Por lo tanto, el resultado principal será el cambio en la carga viral salival entre el inicio y los tres puntos de tiempo posteriores al enjuague bucal en cada tratamiento. Además, también se estudiarán las correlaciones entre la carga viral basal previa al enjuague con los diferentes datos clínicos recogidos, como edad, sexo, días desde la aparición de los síntomas y días desde la positividad del virus de los pacientes determinada por PCR de muestras nasofaríngeas. . Finalmente, se evaluarán las posibles asociaciones entre las variables clínicas categóricas y la frecuencia de pacientes que mejoran en la carga viral en diferentes momentos para los diferentes tratamientos.

Considerando que cada voluntario actúa como su propio control, al comparar los valores de carga viral en saliva en cada momento con respecto a los niveles previos al enjuague con el enjuague bucal, se consideró suficiente un tamaño de muestra de 15 pacientes por rama para identificar diferencias significativas de carga viral. de más del 20% entre puntos temporales, asumiendo un 10% de pérdida de pacientes por abandono o baja carga viral y adoptando un alfa de 0,05 y una potencia de 0,8. Como en el ensayo se programaron 5 ramas (povidona yodada, peróxido de hidrógeno, clorhexidina, cloruro de cetilpiridinio y el control), 75 pacientes fue el número mínimo de individuos totales a reclutar, que se distribuirán entre los diferentes hospitales.

Se usará una prueba de rango con signo de Wilcoxon para probar las diferencias promedio, tanto para el caso apareado (al comparar observaciones en diferentes puntos de tiempo para los mismos individuos) como para el caso no apareado (al comparar diferentes tratamientos basados ​​en cambios relativos de la carga viral). Además, se realizarán algunas pruebas de asociación entre muestras pareadas utilizando los coeficientes de correlación de Spearman para evaluar la relación entre la carga viral y otras variables clínicas continuas. Finalmente, para evaluar asociaciones entre variables categóricas clínicas y la frecuencia de respondedores/no respondedores a los tratamientos, los investigadores realizarán pruebas de tablas de contingencia de chi-cuadrado. Los investigadores definen como respondedor a un individuo que presenta una mejora igual o superior al 90 % de la carga viral basal. Todos los cálculos y pruebas se realizarán utilizando el entorno R para computación estadística versión 3.6.3 y su paquete de 'estadísticas' [R Core Team 2020].

Además, para determinar el efecto de los enjuagues bucales sobre la viabilidad de los virus en saliva, se presentó una adenda al comité de ética del hospital y tras su aprobación, se reclutaron 62 pacientes más para el estudio. En este caso, el protocolo incluía una serie de modificaciones, a saber: (i) el uso de muestras basales, de 30 minutos y de 60 minutos solamente (muestras de 2 horas excluidas); (ii) no usar tampón de inactivación de virus para asegurar la viabilidad viral; (iii) un ensayo de infección in vitro para determinar la capacidad infecciosa de los virus salivales (carga viral infectiva), que se ha incluido como resultado adicional. Los detalles se describen a continuación.

El estudio se realizará en las regiones de Madrid, Valencia y Murcia en España, en cuatro hospitales diferentes: Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz (Madrid, España), Hospital General Universitario de Villalba (Madrid, España), Hospital Universitario Infanta Elena (Madrid, España) y Hospital Universitario Virgen de la Arixaca (Murcia, España).

Se recogerán un total de 3 muestras de saliva no estimulada por cada paciente: una basal y dos tras el enjuague, a los 30 minutos ya los 60 minutos, respectivamente. Se solicitará a los pacientes que aporten cada muestra de saliva no estimulada en un recipiente de plástico estéril de 10 cm de diámetro (al menos 2 mL de muestra) mediante babeo, evitando derramar secreciones de origen bronquial. Las tres muestras se almacenarán inmediatamente a -80ºC en bolsas herméticas hasta su envío al laboratorio. Para el análisis de las muestras, todos los contenedores secundarios de bolsas herméticas con las tres muestras de saliva de cada paciente se introducirán en una caja rígida con hielo seco según norma UN3733 y se enviarán al laboratorio (FISABIO) por servicio de mensajería.

Al recibir las muestras en la Fundación FISABIO, serán procesadas en las instalaciones del laboratorio de seguridad de nivel 3 de la siguiente manera. Después de descongelar las muestras a temperatura ambiente, se tomará una alícuota de 200 uL para la extracción de ARN, y el resto se dividirá en alícuotas y se almacenará inmediatamente a -80 °C para su ensayo en líneas celulares.

La extracción de ARN se realizará con la plataforma totalmente automatizada eMAG (bioMérieux, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante para las muestras de saliva. La rRT-PCR de un paso y la amplificación del SARSCoV-2 se realizarán como se describió anteriormente.

Para el cultivo celular, las células Vero-E6 (ATCC) se cultivan en DMEM suplementado con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S), 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % L-glutamina y HEPES 25 mM. Todas las células se incuban a 37°C y 5% de CO2.

Las muestras de saliva se diluirán 1:1 en PBS de Dulbecco 1X. Se incubarán 300 ul de muestras de saliva diluida durante una hora a 37°C y 5% CO2 con 1,5x105 células Vero-E6 en una placa de 24 pocillos. Se extraerá el virus no unido y se reemplazará el medio por 500 ul de medio de infección (DMEM con 2 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S), 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de L-glutamina, 25 mM de HEPES y Tripsina TPCK 6ug/ml). Las células Vero-E6 infectadas se incubarán a 37 °C y 5 % de CO2. Después de 5 días de infección, se recolectará el sobrenadante para la extracción de ARN siguiendo las instrucciones de la plataforma eMAG y se realizará una rRT-PCR de un paso para la amplificación del SARSCoV-2. La carga viral obtenida después de este período de infección de 5 días se considerará carga viral infectiva.