Antiseptische mondspoelingen om de speekselbelasting bij COVID-19-patiënten te verminderen (BUCOSARS)

Strategieën die de virale belasting van speeksel verminderen, kunnen bijdragen aan het verminderen van het risico op overdracht van SARS-CoV-2. Het gebruik van mondspoelingen met antiseptica die een virusdodende werking hebben, kan dus een eenvoudige en goedkope preventieve strategie zijn die gemakkelijk kan worden toegepast bij de algemene bevolking. Om het effect te evalueren van verschillende antiseptica om de SARS-CoV-2-virale belasting in vivo in speekselmonsters te neutraliseren of te verminderen, is een multicenter, gerandomiseerde, blinde, placebogecontroleerde studie met vijf parallelle groepen opgezet.

De studie zal worden uitgevoerd in de regio's Madrid, Valencia en Murcia in Spanje, in vijf verschillende ziekenhuizen: Universitair Ziekenhuis Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Spanje), Algemeen Universitair Ziekenhuis Villalba (Madrid, Spanje), Universitair Ziekenhuis Infanta Elena (Madrid, Spanje) , Universitair Ziekenhuis Virgen de la Arixaca (Murcia, Spanje) en Universitair Ziekenhuis Clínico de Valencia (Valencia, Spanje).

Elke opgenomen patiënt is eerder gediagnosticeerd en in het ziekenhuis opgenomen vanwege een SARS-COV-2-infectie, voornamelijk opgenomen voor respiratoire pathologie. Ze zullen allemaal volwassen zijn (leeftijd >18 jaar) en hun vrijwillige schriftelijke of mondelinge toestemming geven voor deelname volgens de aanbevelingen van de ethische commissie van het ziekenhuis.

Na goedkeuring van de toestemming zal het ziekenhuispersoneel dat verantwoordelijk is voor de interventies achtereenvolgens elke deelnemer een code toekennen volgens de volgorde van een eerder willekeurig gegenereerde tabel. De code zal bestaan ​​uit een patiëntnummer en een letter die overeenkomt met een van de vijf onderzoeksgroepen (A, B, C, D en E), die bekend zijn bij het klinisch personeel, maar niet bij het laboratoriumpersoneel dat monsters zal verwerken en RNA extraheren, evenals degenen die de gegevens zullen analyseren. Op deze manier worden deelnemers willekeurig toegewezen aan een van de vijf behandelingsgroepen en de blindheid wordt bereikt door identieke buizen met hetzelfde volume te gebruiken voor zowel mondwater als placebo.

Elke geïncludeerde patiënt wordt gevraagd om gedurende een uur voorafgaand aan de monsterafname niets anders te eten, te drinken dan water, kauwgom te kauwen, te roken, zijn tanden te poetsen of mondwater te gebruiken. Daarnaast mogen ze een half uur na het mondwater niet drinken en eten gedurende de hele test.

Er worden vijf mondspoelingen gerandomiseerd: 2% povidon-jodium (groep A), 1% waterstofperoxide (groep B), 0,12% chloorhexidine (groep C), 0,07% cetylpyridiniumchloride (groep D) en gedestilleerd water (groep E), als de controlegroep. Groep C (Clorhexidina dental PHB©) en D (Vitis Xtra Forte©) spoelingen zijn klaar voor gebruik in hun commerciële formules. In het geval van de mondspoelingen A en B moeten de concentraties worden aangepast aan de eerder aangegeven concentraties door commerciële formules minuten voor het spoelen te verdunnen met gedestilleerd water (3 ml povidon-jodium 10% voor oraal gebruik met 12 ml gedestilleerd water, in groep A en 5 ml waterstofperoxide 3%-Oximen© met 10 ml gedestilleerd water, in groep B). Alle mondspoelingen en hun respectieve verdunningen zijn commerciële producten die als veilig zijn geclassificeerd.

Voor elke patiënt worden in totaal 4 niet-gestimuleerde speekselmonsters afgenomen: één basaal en drie na het mondwater, respectievelijk na 30 minuten, na 60 minuten en na 120 minuten. De patiënten zal worden gevraagd om elk niet-gestimuleerd speekselmonster in een steriele plastic container met een diameter van 10 cm (ten minste 0,5 ml monster) te doen door te kwijlen, waarbij het morsen van secreties van bronchiale oorsprong wordt vermeden. Onmiddellijk na elke bemonstering wordt 0,5 ml speeksel overgebracht naar een steriele Eppendorf-buis met 1,5 ml virusinactiverende buffer gelabeld met de patiëntcode en monstertijd en bij 4 °C bewaard. De vier Eppendorf-tubes per patiënt worden ingebracht in een luchtdichte zak, die beschermend absorberend materiaal bevat in geval van ongewenst openen of breken. De secundaire containers worden in een stijve doos volgens de UN3733-normen ingebracht en per koeriersdienst naar het laboratorium gestuurd voor analyse.

Een aliquot van 1 ml van elk speekselmonster, verdund in de virusinactiverende buffer in een verhouding van 1:3, zal worden gebruikt voor RNA-extractie met behulp van een standaard op TRIzol gebaseerde methode. In het kort zullen 3 ml TRIzol en 600 µl chloroform worden toegevoegd, gedurende 15 seconden krachtig worden gevortext en gedurende 10 minuten op ijs worden geïncubeerd. Vervolgens worden de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 12.000 g gecentrifugeerd en wordt de waterige fase overgebracht naar twee schone microbuisjes met 750 µl isopropanol. Buizen worden gemengd door inversie en gedurende 15 minuten geïncubeerd voordat ze gedurende 10 minuten bij 12.000 g bij 4 °C worden gecentrifugeerd. Supernatant wordt verwijderd door decanteren en pellets worden gewassen met 1 ml 80% koude ethanol, gevortext om grondig te mengen en gecentrifugeerd bij 7.500 g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Supernatanten zullen zorgvuldig worden afgezogen en weggegooid, en de pellets worden 10 minuten bij kamertemperatuur gedroogd voordat ze opnieuw worden gesuspendeerd in 15 µl RNAse-vrij water en samengevoegd in een enkele buis.

Eenstaps rRT-PCR wordt uitgevoerd met behulp van SuperScript™ III One-Step RT-PCR-systeem met Platinum™ Taq DNA-polymerase (Invitrogen-12574026) volgens de instructies van de fabrikant. Voor de amplificatie van het SARSCoV-2 E-gen (betacoronavirus screening assay) zal PCR worden uitgevoerd volgens het Charité-Berlin-protocol in een LightCycler 480 2.0 (Roche)-platform. In dezelfde run worden monsters geamplificeerd met RNP-primers van het menselijke gen (Ribonuclease P) om de monsterkwaliteit te beoordelen. Alle monsters worden in twee herhalingen uitgevoerd, samen met eerder bekende positieve en negatieve controles. Viruskopieën zullen worden gekwantificeerd met behulp van een 10-voudige verdunningsstandaardcurve van eerder gegenereerde RNA-transcripten (EDX SARS-CoV-2-standaard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Viruskopieën werden genormaliseerd door ml speeksel.

Wat de uit te voeren analyses betreft, is het hoofddoel van de studie het bepalen van het effect van de verschillende mondspoelingen op de SARS-Cov2-virale lading in in vivo getest speeksel. Het primaire resultaat zal dus de verandering zijn in de virale belasting van het speeksel tussen de basislijn en de drie post-mondwatertijdstippen in elke behandeling. Daarnaast zullen ook de correlaties worden bestudeerd tussen de basale virale belasting voorafgaand aan het spoelen met de verschillende verzamelde klinische gegevens, zoals leeftijd, geslacht, dagen sinds het optreden van symptomen en dagen sinds de viruspositiviteit van de patiënt bepaald door PCR van nasofaryngeale monsters. . Ten slotte zullen de mogelijke associaties tussen categorische klinische variabelen en de frequentie van patiënten die op verschillende tijdstippen voor de verschillende behandelingen verbeteren in virale belasting worden geëvalueerd.

Aangezien elke vrijwilliger als zijn eigen controle fungeert, werd bij het vergelijken van de virale belastingswaarden in speeksel op elk moment met betrekking tot de niveaus voorafgaand aan het spoelen met het mondwater, een steekproefomvang van 15 patiënten per tak voldoende geacht om significante verschillen in virale belasting te identificeren van meer dan 20% tussen tijdspunten, uitgaande van een verlies van 10% van patiënten als gevolg van verlating of lage virale belasting en een alfa van 0,05 en een macht van 0,8. Aangezien er in de studie 5 afdelingen waren geprogrammeerd (povidon-jodium, waterstofperoxide, chloorhexidine, cetylpyridiniumchloride en de controlegroep), waren 75 patiënten het minimale aantal te rekruteren personen, die over de verschillende ziekenhuizen zullen worden verdeeld.

Een Wilcoxon-rangtest zal worden gebruikt om gemiddelde verschillen te testen, zowel voor het gepaarde geval (bij het vergelijken van waarnemingen op verschillende tijdstippen voor dezelfde individuen), als voor het niet-gepaarde geval (bij het vergelijken van verschillende behandelingen op basis van relatieve veranderingen van virale belasting). Bovendien zullen enkele tests voor associatie tussen gepaarde monsters met behulp van Spearman's correlatiecoëfficiënten worden uitgevoerd om de relatie tussen virale belasting en andere klinische continue variabelen te beoordelen. Ten slotte zullen de onderzoekers, om associaties tussen klinische categorische variabelen en de frequentie van responders/non-responders op de behandelingen te evalueren, chi-kwadraat contingentietabeltesten uitvoeren. De onderzoekers definiëren als responder een persoon die een verbetering vertoont die gelijk is aan of groter is dan 90% van de basale virale belasting. Alle berekeningen en tests worden uitgevoerd met behulp van de R-omgeving voor statistische berekeningen versie 3.6.3 en zijn 'statistieken'-pakket [R Core Team 2020].

Om het effect van de mondspoelingen op de levensvatbaarheid van de virussen in speeksel te bepalen, werd bovendien een addendum ingediend bij de ethische commissie van het ziekenhuis en na goedkeuring werden nog 62 patiënten gerekruteerd voor de studie. In dit geval omvatte het protocol een aantal wijzigingen, namelijk: (i) het gebruik van basaal, alleen monsters van 30 minuten en 60 minuten (exclusief monsters van 2 uur); (ii) geen virusinactiverende buffer gebruiken om de levensvatbaarheid van het virus te waarborgen; (iii) een in vitro infectietest om het infectievermogen van de speekselvirussen (infectieuze virale belasting) te bepalen, die als aanvullende uitkomst is opgenomen. De details worden hieronder beschreven.

De studie zal worden uitgevoerd in de regio's Madrid, Valencia en Murcia in Spanje, in vier verschillende ziekenhuizen: Universitair Ziekenhuis Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Spanje), Algemeen Universitair Ziekenhuis Villalba (Madrid, Spanje), Universitair Ziekenhuis Infanta Elena (Madrid, Spanje) en Universitair Ziekenhuis Virgen de la Arixaca (Murcia, Spanje).

Voor elke patiënt worden in totaal 3 niet-gestimuleerde speekselmonsters afgenomen: één basaal en twee na het mondwater, respectievelijk na 30 minuten en na 60 minuten. De patiënten wordt gevraagd om elk niet-gestimuleerd speekselmonster in een steriele plastic container met een diameter van 10 cm (ten minste 2 ml monster) te doen door te kwijlen, waarbij het morsen van secreties van bronchiale oorsprong wordt vermeden. De drie monsters worden onmiddellijk bij -80ºC in luchtdichte zakken bewaard totdat ze naar het laboratorium worden gestuurd. Voor monsteranalyse worden alle secundaire containers met luchtdichte zakken met de drie speekselmonsters van elke patiënt in een stevige doos met droogijs volgens de UN3733-normen gebracht en per koeriersdienst naar het laboratorium (FISABIO) gestuurd.

Bij ontvangst van de monsters bij Stichting FISABIO worden deze als volgt verwerkt in de faciliteiten van het beveiligingslaboratorium niveau 3. Nadat de monsters bij kamertemperatuur zijn ontdooid, wordt een aliquot van 200 µl genomen voor RNA-extractie, en de rest wordt in aliquots verdeeld en onmiddellijk bij -80°C opgeslagen voor analyse in cellijnen.

RNA-extractie zal worden uitgevoerd met het volledig geautomatiseerde platform eMAG (bioMérieux, Frankrijk) volgens de instructies van de fabrikant voor speekselmonsters. Eenstaps rRT-PCR en de amplificatie van de SARSCoV-2 worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven.

Voor de celkweek worden Vero-E6-cellen (ATCC) gekweekt in DMEM aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine (P/S), 1% niet-essentiële aminozuren, 1 % L-glutamine en 25 mM HEPES. Alle cellen worden geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2.

Speekselmonsters worden 1:1 verdund in 1X Dulbecco's PBS. 300 µl verdunde speekselmonsters worden één uur geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 met 1,5 x 105 Vero-E6-cellen in een plaat met 24 putjes. Ongebonden virus wordt geëxtraheerd en de media worden vervangen door 500 µl infectiemedia (DMEM met 2% FBS, 1% penicilline/streptomycine (P/S), 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine, 25 mM HEPES en Tripsine TPCK 6ug/ml). Geïnfecteerde Vero-E6-cellen worden geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Na 5 dagen infectie wordt supernatant verzameld voor RNA-extractie volgens de instructies van het eMAG-platform en wordt een staps rRT-PCR uitgevoerd voor de amplificatie van de SARSCoV-2. De virale belasting die na deze infectieperiode van 5 dagen wordt verkregen, wordt beschouwd als de infectieuze virale belasting.