Rince-bouche antiseptique pour réduire la charge virale salivaire chez les patients COVID-19 (BUCOSARS)

Des stratégies de réduction de la charge virale salivaire pourraient contribuer à réduire le risque de transmission du SARS-CoV-2. Ainsi, l'utilisation de bains de bouche avec des antiseptiques ayant une activité virucide peut être une stratégie préventive simple et peu coûteuse qui pourrait facilement être appliquée dans la population générale. Pour évaluer l'effet de plusieurs antiseptiques pour neutraliser ou réduire la charge virale du SRAS-CoV-2 in vivo dans des échantillons de salive, un essai multicentrique, randomisé, en aveugle, en cinq groupes parallèles et contrôlé par placebo a été conçu.

L'étude sera réalisée dans les régions de Madrid, Valence et Murcie en Espagne, dans cinq hôpitaux différents : Hôpital universitaire Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espagne), Hôpital général universitaire Villalba (Madrid, Espagne), Hôpital universitaire Infanta Elena (Madrid, Espagne) , Hôpital universitaire Virgen de la Arixaca (Murcie, Espagne) et Hôpital universitaire Clínico de Valencia (Valence, Espagne).

Chaque patient inclus est préalablement diagnostiqué et hospitalisé en raison d'une infection par le SRAS-COV-2, étant admis principalement pour une pathologie respiratoire. Tous seront des adultes (âge > 18 ans) et fourniront leur consentement volontaire écrit ou oral à la participation conformément aux recommandations du comité d'éthique de l'hôpital.

Après approbation du consentement, le personnel hospitalier responsable des interventions attribuera consécutivement à chaque participant un code suivant l'ordre d'un tableau préalablement généré aléatoirement. Le code sera composé d'un numéro de patient et d'une lettre correspondant à l'un des cinq groupes d'étude (A, B, C, D et E), qui seront connus du personnel clinique mais inconnus du personnel du laboratoire qui traitera les échantillons et extraire l'ARN, ainsi qu'à ceux qui analyseront les données. De cette manière, les participants seront assignés au hasard à l'un des cinq groupes de traitement et l'aveugle sera atteint en utilisant des tubes identiques avec le même volume pour les bains de bouche et le placebo.

Chaque patient inclus est invité à ne pas manger, boire autre chose que de l'eau, mâcher de la gomme, fumer, se brosser les dents ou utiliser un rince-bouche pendant une heure avant le prélèvement de l'échantillon. De plus, ils ne sont pas autorisés à boire pendant une demi-heure après le bain de bouche et à manger pendant tout le test.

Cinq bains de bouche sont randomisés : 2 % de povidone iodée (groupe A), 1 % de peroxyde d'hydrogène (groupe B), 0,12 % de chlorhexidine (groupe C), 0,07 % de chlorure de cétylpyridinium (groupe D) et de l'eau distillée (groupe E). groupe de contrôle. Les rince-bouche du groupe C (Clorhexidina dental PHB©) et D (Vitis Xtra Forte©) sont prêts à l'emploi dans leurs formules commerciales. Dans le cas des bains de bouche A et B, les concentrations doivent être ajustées à celles précédemment indiquées en diluant les formules commerciales avec de l'eau distillée quelques minutes avant le rinçage (3 mL de povidone iodée 10 % pour voie orale avec 12 mL d'eau distillée, en groupe A ; et 5 mL de peroxyde d'hydrogène 3 %-Oximen© avec 10 mL d'eau distillée, dans le groupe B). Tous les bains de bouche et leurs dilutions respectives sont des produits commerciaux classés comme sûrs.

Un total de 4 échantillons de salive non stimulés seront prélevés pour chaque patient : un basal et trois après le bain de bouche, respectivement à 30 minutes, à 60 minutes et à 120 minutes. Les patients seront invités à fournir chaque échantillon de salive non stimulée dans un récipient en plastique stérile de 10 cm de diamètre (au moins 0,5 ml d'échantillon) en bavant, en évitant de renverser des sécrétions d'origine bronchique. Immédiatement après chaque prélèvement, 0,5 mL de salive sera transféré dans un tube Eppendorf stérile avec 1,5 mL de tampon d'inactivation virale étiqueté avec le code patient et l'heure de l'échantillon et conservé à 4 °C. Les quatre tubes Eppendorf par patient seront introduits dans un sac hermétique, contenant un matériau absorbant protecteur en cas d'ouverture ou de rupture intempestive. Les contenants secondaires seront introduits dans une boîte rigide selon les normes UN3733 et envoyés au laboratoire par service de messagerie pour analyse.

Une aliquote de 1 ml de chaque échantillon de salive dilué dans le tampon d'inactivation du virus en proportion 1:3, sera utilisée pour l'extraction de l'ARN en utilisant une méthode standard à base de TRIzol. En bref, 3 ml de TRIzol et 600 ul de chloroforme seront ajoutés, vortexés vigoureusement pendant 15 secondes et incubés sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, les échantillons seront centrifugés à 12 000 g pendant 15 min à 4 °C et la phase aqueuse transférée dans deux microtubes propres avec 750 ul d'isopropanol. Les tubes seront mélangés par inversion et incubés pendant 15 minutes avant centrifugation à 12 000 g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant sera éliminé par décantation et les culots lavés avec 1 ml d'éthanol froid à 80 %, vortexés pour bien mélanger et centrifugés à 7 500 g pendant 5 minutes à 4 °C. Les surnageants seront soigneusement aspirés et jetés, et les culots séchés à température ambiante pendant 10 minutes avant d'être remis en suspension dans 15 ul d'eau sans ARNase et regroupés dans un seul tube.

La rRT-PCR en une étape sera effectuée à l'aide du système de RT-PCR en une étape SuperScript™ III avec l'ADN polymérase Platinum™ Taq (Invitrogen-12574026) conformément aux instructions du fabricant. Pour l'amplification du gène SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay), la PCR sera réalisée selon le protocole Charité-Berlin dans une plateforme LightCycler 480 2.0 (Roche). Dans le même cycle, les échantillons seront amplifiés avec des amorces RNP (ribonucléase P) du gène humain domestique pour évaluer la qualité des échantillons. Tous les échantillons seront analysés en deux répétitions, avec des contrôles positifs et négatifs précédemment connus. Les copies de virus seront quantifiées à l'aide d'une courbe standard de dilution de 10 fois des transcrits d'ARN précédemment générés (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Les copies de virus ont été normalisées par ml de salive.

Concernant les analyses à réaliser, l'objectif principal de l'étude est de déterminer l'effet des différents bains de bouche sur la charge virale SARS-Cov2 dans la salive testée in vivo. Ainsi, le résultat principal sera le changement de la charge virale salivaire entre la ligne de base et les trois points temporels post-rince-bouche dans chaque traitement. De plus, les corrélations entre la charge virale basale avant rinçage avec les différentes données cliniques recueillies, telles que l'âge, le sexe, les jours depuis l'apparition des symptômes et les jours depuis la positivité virale des patients déterminée par PCR d'échantillons nasopharyngés seront également étudiées . Enfin, les associations possibles entre les variables cliniques catégorielles et la fréquence des patients dont la charge virale s'améliore à différents moments pour les différents traitements seront évaluées.

Considérant que chaque volontaire agit comme son propre témoin, lors de la comparaison des valeurs de charge virale dans la salive à chaque instant par rapport aux niveaux avant le rinçage avec le rince-bouche, une taille d'échantillon de 15 patients par branche a été considérée comme suffisante pour identifier des différences significatives de charge virale de plus de 20 % entre les points temporels, en supposant une perte de 10 % de patients due à un abandon ou à une faible charge virale et en adoptant un alpha de 0,05 et une puissance de 0,8. Comme 5 branches étaient programmées dans l'essai (povidone-iode, peroxyde d'hydrogène, chlorhexidine, chlorure de cétylpyridinium et le contrôle), 75 patients étaient le nombre minimum d'individus totaux à recruter, qui seront répartis entre les différents hôpitaux.

Un test de rang signé de Wilcoxon sera utilisé pour tester les différences moyennes, à la fois pour le cas apparié (lors de la comparaison des observations à différents moments pour les mêmes individus) et pour le cas non apparié (lors de la comparaison de différents traitements basés sur des changements relatifs de charge virale). De plus, certains tests d'association entre échantillons appariés utilisant les coefficients de corrélation de Spearman seront effectués pour évaluer la relation entre la charge virale et d'autres variables cliniques continues. Enfin, afin d'évaluer les associations entre les variables catégorielles cliniques et la fréquence des répondeurs/non-répondeurs aux traitements, les investigateurs réaliseront des tests de tableau de contingence du chi carré. Les investigateurs définissent comme répondeur un individu présentant une amélioration égale ou supérieure à 90% de la charge virale basale. Tous les calculs et tests seront effectués en utilisant l'environnement R pour le calcul statistique version 3.6.3 et son package 'stats' [R Core Team 2020].

De plus, pour déterminer l'effet des bains de bouche sur la viabilité des virus dans la salive, un addendum a été soumis au comité d'éthique de l'hôpital et après son approbation, 62 patients supplémentaires ont été recrutés pour l'étude. Dans ce cas, le protocole comprenait un certain nombre de modifications, à savoir : (i) l'utilisation d'échantillons de base, de 30 minutes et de 60 minutes uniquement (échantillons de 2 heures exclus ); (ii) ne pas utiliser de tampon inactivant les virus pour assurer la viabilité virale ; (iii) un test d'infection in vitro pour déterminer la capacité infectieuse des virus salivaires (charge virale infectieuse), qui a été inclus comme résultat supplémentaire. Les détails sont décrits ci-dessous.

L'étude sera réalisée dans les régions de Madrid, Valence et Murcie en Espagne, dans quatre hôpitaux différents : Hôpital universitaire Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espagne), Hôpital général universitaire Villalba (Madrid, Espagne), Hôpital universitaire Infanta Elena (Madrid, Espagne) et l'hôpital universitaire Virgen de la Arixaca (Murcie, Espagne).

Un total de 3 échantillons de salive non stimulés seront prélevés pour chaque patient : un basal et deux après le bain de bouche, à 30 minutes et à 60 minutes, respectivement. Les patients seront invités à fournir chaque échantillon de salive non stimulée dans un récipient en plastique stérile de 10 cm de diamètre (au moins 2 mL d'échantillon) en bavant, en évitant de renverser des sécrétions d'origine bronchique. Les trois échantillons seront immédiatement stockés à -80°C dans des sacs hermétiques jusqu'à leur envoi au laboratoire. Pour l'analyse des échantillons, tous les contenants secondaires de sacs hermétiques avec les trois échantillons de salive de chaque patient seront introduits dans une boîte rigide avec de la neige carbonique selon les normes UN3733 et envoyés au laboratoire (FISABIO) par service de messagerie.

Lors de la réception des échantillons à la Fondation FISABIO, ils seront traités dans les installations du laboratoire de sécurité de niveau 3 comme suit. Après décongélation des échantillons à température ambiante, une aliquote de 200 uL sera prélevée pour l'extraction de l'ARN, et le reste sera aliquoté et immédiatement stocké à -80°C pour dosage dans des lignées cellulaires.

L'extraction d'ARN sera réalisée avec la plateforme entièrement automatisée eMAG (bioMérieux, France) en suivant les instructions du fabricant pour les échantillons de salive. Une étape rRT-PCR et l'amplification du SARSCoV-2 seront effectuées comme décrit ci-dessus.

Pour la culture cellulaire, les cellules Vero-E6 (ATCC) sont cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % de L-glutamine et HEPES 25 mM. Toutes les cellules sont incubées à 37°C et 5% de CO2.

Les échantillons de salive seront dilués 1:1 dans du PBS 1X Dulbecco. 300 ul d'échantillons de salive diluée seront incubés pendant une heure à 37 °C et 5 % de CO2 avec 1,5 x 105 cellules Vero-E6 dans une plaque à 24 puits. Le virus non lié sera extrait et le milieu remplacé par 500 ul de milieu d'infection (DMEM avec 2 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % de L-glutamine, 25 mM d'HEPES et Tripsine TPCK 6ug/ml). Les cellules Vero-E6 infectées seront incubées à 37°C et 5% de CO2. Après 5 jours d'infection, le surnageant sera collecté pour l'extraction de l'ARN en suivant les instructions de la plateforme eMAG et une étape rRT-PCR effectuée pour l'amplification du SARSCoV-2. La charge virale obtenue après cette période d'infection de 5 jours sera considérée comme la charge virale infectieuse.