Antiseptische Mundspülungen zur Reduzierung der Viruslast im Speichel bei COVID-19-Patienten (BUCOSARS)

Strategien zur Reduzierung der Viruslast im Speichel könnten dazu beitragen, das Übertragungsrisiko von SARS-CoV-2 zu verringern. Daher kann die Verwendung von Mundwässern mit Antiseptika mit viruzider Aktivität eine einfache und kostengünstige Präventionsstrategie sein, die leicht in der allgemeinen Bevölkerung angewendet werden könnte. Um die Wirkung mehrerer Antiseptika zur Neutralisierung oder Verringerung der SARS-CoV-2-Viruslast in vivo in Speichelproben zu bewerten, wurde eine multizentrische, randomisierte, blinde, Placebo-kontrollierte Studie mit fünf Parallelgruppen konzipiert.

Die Studie wird in den Regionen Madrid, Valencia und Murcia in Spanien in fünf verschiedenen Krankenhäusern durchgeführt: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spanien), Villalba University General Hospital (Madrid, Spanien), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spanien) , Universitätskrankenhaus Virgen de la Arixaca (Murcia, Spanien) und Universitätskrankenhaus Clínico de Valencia (Valencia, Spanien).

Jeder eingeschlossene Patient wurde zuvor wegen einer SARS-COV-2-Infektion diagnostiziert und ins Krankenhaus eingeliefert, wobei er hauptsächlich zur Atemwegspathologie eingeliefert wurde. Alle von ihnen sind Erwachsene (Alter > 18 Jahre) und geben ihr freiwilliges schriftliches oder mündliches Einverständnis zur Teilnahme gemäß den Empfehlungen der Ethikkommission des Krankenhauses.

Nach Genehmigung der Zustimmung wird das für die Interventionen zuständige Krankenhauspersonal jedem Teilnehmer nacheinander einen Code in der Reihenfolge aus einer zuvor zufällig generierten Tabelle zuweisen. Der Code besteht aus einer Patientennummer und einem Buchstaben, der einer der fünf Studiengruppen (A, B, C, D und E) entspricht, die dem klinischen Personal bekannt, aber dem Laborpersonal, das die Proben verarbeitet, unbekannt sind RNA extrahieren, sowie an diejenigen, die die Daten analysieren. Auf diese Weise werden die Teilnehmer nach dem Zufallsprinzip einer der fünf Behandlungsgruppen zugeteilt und die Blindheit wird erreicht, indem identische Röhrchen mit demselben Volumen sowohl für Mundspülungen als auch für Placebo verwendet werden.

Jeder eingeschlossene Patient wird gebeten, eine Stunde vor der Probenentnahme nichts zu essen, nichts anderes als Wasser zu trinken, Kaugummi zu kauen, zu rauchen, sich die Zähne zu putzen oder Mundwasser zu verwenden. Außerdem dürfen sie nach der Mundspülung eine halbe Stunde lang nichts trinken und während des gesamten Tests nicht essen.

Fünf Mundspülungen werden randomisiert: 2 % Povidon-Jod (Gruppe A), 1 % Wasserstoffperoxid (Gruppe B), 0,12 % Chlorhexidin (Gruppe C), 0,07 % Cetylpyridiniumchlorid (Gruppe D) und destilliertes Wasser (Gruppe E), als die Kontrollgruppe. Spülungen der Gruppen C (Clorhexidina dental PHB©) und D (Vitis Xtra Forte©) sind in ihren handelsüblichen Formeln gebrauchsfertig. Bei den Mundwässern A und B müssen die Konzentrationen auf die zuvor angegebenen Konzentrationen eingestellt werden, indem handelsübliche Formulierungen Minuten vor dem Spülen mit destilliertem Wasser verdünnt werden (3 ml Povidon-Jod 10 % zur oralen Anwendung mit 12 ml destilliertem Wasser, in Gruppe A und 5 ml Wasserstoffperoxid 3 %-Oximen® mit 10 ml destilliertem Wasser in Gruppe B). Alle Mundspülungen und ihre jeweiligen Verdünnungen sind als unbedenklich eingestufte Handelsprodukte.

Für jeden Patienten werden insgesamt 4 nicht stimulierte Speichelproben entnommen: eine basale und drei nach der Mundspülung jeweils nach 30 Minuten, nach 60 Minuten und nach 120 Minuten. Die Patienten werden gebeten, jede unstimulierte Speichelprobe durch Sabbern in einen sterilen Kunststoffbehälter mit 10 cm Durchmesser (mindestens 0,5 ml Probe) zu geben, wobei das Verschütten von Sekreten bronchialen Ursprungs vermieden wird. Unmittelbar nach jeder Probenahme werden 0,5 ml Speichel in ein steriles Eppendorf-Röhrchen mit 1,5 ml virusinaktivierendem Puffer, der mit dem Patientencode und der Probenahmezeit gekennzeichnet ist, überführt und bei 4 °C aufbewahrt. Die vier Eppendorf-Röhrchen pro Patient werden in einem luftdichten Beutel verpackt, der schützendes saugfähiges Material für den Fall eines unerwünschten Öffnens oder Brechens enthält. Die sekundären Behälter werden in einer starren Kiste gemäß den UN3733-Standards eingeführt und per Kurierdienst zur Analyse an das Labor geschickt.

Ein Aliquot von 1 ml jeder Speichelprobe, verdünnt im Virusinaktivierungspuffer im Verhältnis 1:3, wird für die RNA-Extraktion unter Verwendung einer Standardmethode auf TRIzol-Basis verwendet. Kurz gesagt werden 3 ml TRIzol und 600 ul Chloroform zugegeben, 15 Sekunden kräftig verwirbelt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Dann werden die Proben bei 12.000 g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und die wässrige Phase in zwei saubere Mikroröhrchen mit 750 ul Isopropanol überführt. Die Röhrchen werden durch Umdrehen gemischt und 15 Minuten lang inkubiert, bevor sie 10 Minuten lang bei 12.000 g bei 4 °C zentrifugiert werden. Der Überstand wird durch Dekantieren verworfen und die Pellets mit 1 ml 80 % kaltem Ethanol gewaschen, zum gründlichen Mischen gevortext und bei 7.500 g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände werden sorgfältig abgesaugt und verworfen, und die Pellets werden 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet, bevor sie in 15 ul RNAse-freiem Wasser resuspendiert und in einem einzigen Röhrchen gepoolt werden.

Die einstufige rRT-PCR wird mit dem SuperScript™ III One-Step RT-PCR System mit Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen-12574026) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für die Amplifikation des SARSCoV-2 E (Betacoronavirus Screening Assay)-Gens wird eine PCR nach dem Charité-Berlin-Protokoll auf einer LightCycler 480 2.0 (Roche)-Plattform durchgeführt. Im gleichen Durchlauf werden die Proben mit RNP (Ribonuklease P)-Primern des humanen Haushaltsgens amplifiziert, um die Probenqualität zu beurteilen. Alle Proben werden in zwei Wiederholungen zusammen mit einer zuvor bekannten Positiv- und Negativkontrolle getestet. Viruskopien werden unter Verwendung einer 10-fachen Verdünnungsstandardkurve von zuvor generierten RNA-Transkripten (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX) quantifiziert. Viruskopien wurden durch ml Speichel normalisiert.

In Bezug auf die durchzuführenden Analysen besteht das Hauptziel der Studie darin, die Wirkung der verschiedenen Mundspülungen auf die SARS-Cov2-Viruslast im in vivo getesteten Speichel zu bestimmen. Daher wird das primäre Ergebnis die Veränderung der Viruslast im Speichel zwischen dem Ausgangswert und den drei Zeitpunkten nach der Mundspülung bei jeder Behandlung sein. Darüber hinaus werden die Korrelationen zwischen der basalen Viruslast vor der Spülung mit den unterschiedlichen erhobenen klinischen Daten wie Alter, Geschlecht, Tage seit Auftreten der Symptome und Tage seit der Viruspositivität der Patienten, bestimmt durch PCR von Nasen-Rachen-Proben, untersucht . Schließlich werden die möglichen Zusammenhänge zwischen kategorialen klinischen Variablen und der Häufigkeit von Patienten, deren Viruslast sich zu unterschiedlichen Zeiten für die verschiedenen Behandlungen verbessert, bewertet.

In Anbetracht der Tatsache, dass jeder Freiwillige als seine eigene Kontrolle fungiert, wurde beim Vergleich der Viruslastwerte im Speichel zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf die Werte vor dem Spülen mit der Mundspülung eine Stichprobengröße von 15 Patienten pro Zweig als ausreichend erachtet, um signifikante Unterschiede in der Viruslast zu identifizieren von mehr als 20 % zwischen den Zeitpunkten, unter der Annahme eines 10 %igen Patientenverlusts aufgrund von Abbruch oder niedriger Viruslast und Annahme eines Alphas von 0,05 und einer Potenz von 0,8. Da in der Studie 5 Verzweigungen programmiert waren (Povidon-Jod, Wasserstoffperoxid, Chlorhexidin, Cetylpyridiniumchlorid und die Kontrolle), waren 75 Patienten die Mindestanzahl von insgesamt zu rekrutierenden Personen, die auf die verschiedenen Krankenhäuser verteilt werden.

Ein Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wird verwendet, um durchschnittliche Unterschiede zu testen, sowohl für den gepaarten Fall (beim Vergleichen von Beobachtungen zu verschiedenen Zeitpunkten für dieselben Personen) als auch für den ungepaarten Fall (beim Vergleichen verschiedener Behandlungen basierend auf relativen Änderungen von Viruslast). Darüber hinaus werden einige Tests zur Assoziation zwischen gepaarten Proben unter Verwendung von Korrelationskoeffizienten nach Spearman durchgeführt, um die Beziehung zwischen Viruslast und anderen klinischen kontinuierlichen Variablen zu bewerten. Um die Zusammenhänge zwischen klinischen kategorialen Variablen und der Häufigkeit von Respondern/Non-Respondern auf die Behandlungen zu bewerten, führen die Forscher schließlich Chi-Quadrat-Kontingenztabellentests durch. Die Forscher definieren als Responder eine Person, die eine Verbesserung gleich oder größer als 90 % der basalen Viruslast aufweist. Alle Berechnungen und Tests werden mit der R-Umgebung für statistische Berechnungen, Version 3.6.3, durchgeführt und sein „Statistik“-Paket [R Core Team 2020].

Darüber hinaus wurde zur Bestimmung der Wirkung der Mundwässer auf die Lebensfähigkeit der Viren im Speichel ein Addendum bei der Ethikkommission des Krankenhauses eingereicht und nach dessen Genehmigung 62 weitere Patienten für die Studie rekrutiert. In diesem Fall enthielt das Protokoll eine Reihe von Modifikationen, nämlich: (i) die Verwendung von nur Basal-, 30-Minuten- und 60-Minuten-Proben (2-Stunden-Proben ausgeschlossen); (ii) kein Virus-inaktivierender Puffer verwendet wird, um die Lebensfähigkeit des Virus sicherzustellen; (iii) ein In-vitro-Infektionstest zur Bestimmung der Infektionsfähigkeit der Speichelviren (infektiöse Viruslast), der als zusätzliches Ergebnis aufgenommen wurde. Die Einzelheiten sind unten beschrieben.

Die Studie wird in den spanischen Regionen Madrid, Valencia und Murcia in vier verschiedenen Krankenhäusern durchgeführt: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spanien), Villalba University General Hospital (Madrid, Spanien), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spanien) und Universitätskrankenhaus Virgen de la Arixaca (Murcia, Spanien).

Für jeden Patienten werden insgesamt 3 nicht stimulierte Speichelproben entnommen: eine basale und zwei nach der Mundspülung nach 30 Minuten bzw. nach 60 Minuten. Die Patienten werden gebeten, jede unstimulierte Speichelprobe durch Sabbern in einen sterilen Kunststoffbehälter mit 10 cm Durchmesser (mindestens 2 ml Probe) zu geben, wobei ein Verschütten von Sekreten bronchialen Ursprungs vermieden wird. Die drei Proben werden sofort bei -80 °C in luftdichten Beuteln gelagert, bis sie ins Labor geschickt werden. Für die Probenanalyse werden alle sekundären Behälter mit luftdichten Beuteln mit den drei Speichelproben jedes Patienten in eine starre Box mit Trockeneis gemäß den UN3733-Standards gefüllt und per Kurierdienst an das Labor (FISABIO) gesendet.

Nach Erhalt der Proben bei der FISABIO-Stiftung werden sie in den Einrichtungen des Sicherheitslabors der Stufe 3 wie folgt verarbeitet. Nach dem Auftauen der Proben bei Raumtemperatur wird ein 200-ul-Aliquot für die RNA-Extraktion entnommen, und der Rest wird aliquotiert und sofort bei -80 °C für den Assay in Zelllinien gelagert.

Die RNA-Extraktion wird mit der vollautomatischen Plattform eMAG (bioMérieux, Frankreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers für Speichelproben durchgeführt. Die einstufige rRT-PCR und die Amplifikation des SARSCoV-2 werden wie oben beschrieben durchgeführt.

Für die Zellkultur werden Vero-E6-Zellen (ATCC) in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % L-Glutamin und 25 mM HEPES. Alle Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Speichelproben werden 1:1 in 1X Dulbecco's PBS verdünnt. 300 ul verdünnter Speichelproben werden für eine Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 mit 1,5 x 105 Vero-E6-Zellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen inkubiert. Ungebundenes Virus wird extrahiert und das Medium durch 500 ul Infektionsmedium (DMEM mit 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % L-Glutamin, 25 mM HEPES u Tripsin TPCK 6 ug/ml). Infizierte Vero-E6-Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 5 Tagen Infektion wird der Überstand für die RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen der eMAG-Plattform gesammelt und eine einstufige rRT-PCR zur Amplifikation des SARSCoV-2 durchgeführt. Die Viruslast, die nach dieser 5-tägigen Infektionsperiode erreicht wird, wird als infektiöse Viruslast betrachtet.