Antiseptické ústní výplachy ke snížení virové zátěže slin u pacientů s COVID-19 (BUCOSARS)

Strategie snižující virovou nálož slin by mohly přispět ke snížení rizika přenosu SARS-CoV-2. Použití ústních vod s antiseptiky, která mají virucidní aktivitu, tedy může být jednoduchou a levnou preventivní strategií, kterou lze snadno aplikovat v běžné populaci. K vyhodnocení účinku několika antiseptik na neutralizaci nebo snížení virové zátěže SARS-CoV-2 in vivo ve vzorcích slin byla navržena multicentrická, randomizovaná, slepá, pětiparalelní, placebem kontrolovaná studie.

Studie bude provedena v regionech Madrid, Valencia a Murcia ve Španělsku, v pěti různých nemocnicích: Univerzitní nemocnice Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Španělsko), Univerzitní všeobecná nemocnice Villalba (Madrid, Španělsko), Univerzitní nemocnice Infanta Elena (Madrid, Španělsko) , Fakultní nemocnice Virgen de la Arixaca (Murcia, Španělsko) a Univerzitní nemocnice Clínico de Valencia (Valencia, Španělsko).

Každý zahrnutý pacient je dříve diagnostikován a hospitalizován kvůli infekci SARS-COV-2, přičemž byl přijat hlavně pro respirační patologii. Všichni budou dospělí (věk > 18 let) a poskytnou svůj dobrovolný písemný nebo ústní souhlas s účastí v souladu s doporučeními etické komise nemocnice.

Po schválení souhlasu nemocniční personál odpovědný za intervence postupně přiřadí každému účastníkovi kód podle pořadí z dříve náhodně vygenerované tabulky. Kód se bude skládat z čísla pacienta a písmene odpovídající jedné z pěti studijních skupin (A, B, C, D a E), které budou známy klinickému personálu, ale neznámé laboratornímu personálu, který bude zpracovávat vzorky a extrahovat RNA a také těm, které budou analyzovat data. Tímto způsobem budou účastníci náhodně rozděleni do jedné z pěti léčebných skupin a slepí budou dosaženi použitím identických zkumavek se stejným objemem pro ústní vody i placebo.

Každý zahrnutý pacient je požádán, aby jednu hodinu před odběrem vzorku nejedl, nepil nic jiného než vodu, nežvýkal žvýkačku, nekouřil, čistil si zuby a nepoužíval ústní vodu. Po celou dobu testu navíc nesmí půl hodiny po ústní vodě pít a jíst.

Je randomizováno pět ústních vod: 2 % povidon-jod (skupina A), 1 % peroxid vodíku (skupina B), 0,12 % chlorhexidin (skupina C), 0,07 % cetylpyridiniumchlorid (skupina D) a destilovaná voda (skupina E). kontrolní skupina. Oplachy skupiny C (Clorhexidina dentální PHB©) a D (Vitis Xtra Forte©) jsou připraveny k použití ve svých komerčních recepturách. V případě ústních vod A a B je třeba koncentrace upravit na výše uvedené koncentrace zředěním komerčních přípravků destilovanou vodou minut před vypláchnutím (3 ml povidon-jódu 10% pro perorální použití s ​​12 ml destilované vody, v skupina A a 5 ml peroxidu vodíku 3%-Oximen© s 10 ml destilované vody, ve skupině B). Všechny ústní vody a jejich příslušná ředění jsou komerční produkty klasifikované jako bezpečné.

U každého pacienta budou odebrány celkem 4 nestimulované vzorky slin: jeden bazální a tři po ústní vodě po 30 minutách, po 60 minutách a po 120 minutách. Pacienti budou požádáni, aby poskytli každý nestimulovaný vzorek slin do sterilní plastové nádobky o průměru 10 cm (alespoň 0,5 ml vzorku) slintáním, aby se zabránilo rozlití sekretů bronchiálního původu. Bezprostředně po každém odběru vzorků se 0,5 ml slin přenese do sterilní Eppendorfovy zkumavky s 1,5 ml pufru inaktivujícího viry označeného kódem pacienta a časem odběru a udrží se při 4 °C. Čtyři zkumavky Eppendorf na pacienta budou vloženy do vzduchotěsného vaku obsahujícího ochranný absorpční materiál v případě nežádoucího otevření nebo rozbití. Sekundární kontejnery budou vloženy do pevné krabice podle norem UN3733 a odeslány do laboratoře kurýrní službou k analýze.

Alikvot 1 ml každého vzorku slin naředěný v pufru inaktivujícím virus v poměru 1:3 bude použit pro extrakci RNA standardní metodou na bázi TRIzolu. Krátce, přidají se 3 ml TRIzolu a 600 ul chloroformu, 15 sekund se intenzivně vortexuje a 10 minut se inkubuje na ledu. Poté se vzorky odstředí při 12 000 g po dobu 15 minut při 4 °C a vodná fáze se přenese do dvou čistých mikrozkumavek se 750 ul isopropanolu. Zkumavky budou promíchány převrácením a inkubovány po dobu 15 minut před centrifugací při 12 000 g po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatant se odstraní dekantací a pelety se promyjí 1 ml 80% studeného ethanolu, vortexují, aby se důkladně promíchaly, a odstřeďují se při 7 500 g po dobu 5 minut při 4 °C. Supernatanty se opatrně odsají a zlikvidují a pelety se suší při teplotě místnosti po dobu 10 minut, než se resuspendují v 15 ul vody bez RNázy a spojí se do jedné zkumavky.

Jednokroková rRT-PCR bude provedena pomocí systému SuperScript™ III One-Step RT-PCR System s Platinum™ Taq DNA polymerázou (Invitrogen-12574026) podle pokynů výrobce. Pro amplifikaci genu SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay) bude PCR provedena podle protokolu Charité-Berlin na platformě LightCycler 480 2.0 (Roche). Ve stejném běhu budou vzorky amplifikovány primery RNP (Ribonuclease P) pro lidský gen, aby se vyhodnotila kvalita vzorku. Všechny vzorky budou testovány ve dvou replikátech spolu s dříve známými pozitivními a negativními kontrolami. Kopie viru budou kvantifikovány pomocí 10násobné standardní křivky ředění dříve vytvořených transkriptů RNA (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Kopie viru byly normalizovány pomocí ml slin.

Pokud jde o analýzy, které mají být provedeny, hlavním cílem studie je určit účinek různých ústních vod na virovou zátěž SARS-Cov2 ve slinách testovaných in vivo. Primárním výsledkem tedy bude změna virové nálože slin mezi výchozí hodnotou a třemi časovými body po vyplachování úst v každé léčbě. Kromě toho budou také studovány korelace mezi bazální virovou zátěží před výplachem s různými shromážděnými klinickými údaji, jako je věk, pohlaví, dny od objevení se příznaků a dny od virové pozitivity pacientů stanovené pomocí PCR vzorků z nosohltanu. . Nakonec budou vyhodnoceny možné souvislosti mezi kategorickými klinickými proměnnými a frekvencí pacientů, u kterých došlo ke zlepšení virové nálože v různých časech pro různé léčby.

Vzhledem k tomu, že každý dobrovolník působí jako vlastní kontrola, při porovnávání hodnot virové nálože ve slinách v každém okamžiku s ohledem na hladiny před vypláchnutím ústní vodou se velikost vzorku 15 pacientů na větev považovala za dostatečnou k identifikaci významných rozdílů ve virové náloži. více než 20 % mezi časovými body, za předpokladu 10% ztráty pacientů v důsledku opuštění nebo nízké virové zátěže a přijetí alfa 0,05 a mocniny 0,8. Vzhledem k tomu, že ve studii bylo naprogramováno 5 větví (povidon-jod, peroxid vodíku, chlorhexidin, cetylpyridiniumchlorid a kontrola), 75 pacientů představovalo minimální počet z celkového počtu jednotlivců, kteří měli být přijati, kteří budou rozděleni mezi různé nemocnice.

Wilcoxonův test se znaménkem bude použit k testování průměrných rozdílů, a to jak pro párový případ (při porovnávání pozorování v různých časových bodech u stejných jedinců), tak pro nepárový případ (při porovnávání různých léčeb na základě relativních změn virová nálož). Kromě toho budou provedeny některé testy na asociaci mezi párovými vzorky pomocí Spearmanových korelačních koeficientů, aby se vyhodnotil vztah mezi virovou zátěží a dalšími klinickými spojitými proměnnými. Nakonec, aby bylo možné vyhodnotit souvislosti mezi klinickými kategorickými proměnnými a frekvencí respondentů/nereagujících na léčbu, výzkumníci provedou testy kontingenční tabulky chí-kvadrát. Výzkumníci definují jako respondéra jedince vykazujícího zlepšení rovné nebo větší než 90 % bazální virové nálože. Všechny výpočty a testy budou prováděny v prostředí R pro statistické výpočty verze 3.6.3 a jeho balíček „statistiky“ [R Core Team 2020].

Pro zjištění vlivu ústních vod na životaschopnost virů ve slinách byl navíc etické komisi nemocnice předložen dodatek a po jeho schválení bylo do studie přijato dalších 62 pacientů. V tomto případě protokol zahrnoval řadu úprav, konkrétně: (i) použití pouze bazálních, 30minutových a 60minutových vzorků (vyloučeny 2hodinové vzorky); (ii) nepoužívání pufru inaktivujícího virus k zajištění životaschopnosti viru; iii) test infekce in vitro ke stanovení infekční kapacity slinných virů (infekční virová zátěž), ​​který byl zahrnut jako další výsledek. Podrobnosti jsou popsány níže.

Studie bude provedena v regionech Madrid, Valencia a Murcia ve Španělsku, ve čtyřech různých nemocnicích: Fakultní nemocnice Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Španělsko), Univerzitní všeobecná nemocnice Villalba (Madrid, Španělsko), Univerzitní nemocnice Infanta Elena (Madrid, Španělsko) a Univerzitní nemocnice Virgen de la Arixaca (Murcia, Španělsko).

U každého pacienta budou odebrány celkem 3 nestimulované vzorky slin: jeden bazální a dva po ústní vodě po 30 minutách a po 60 minutách. Pacienti budou požádáni, aby poskytli každý nestimulovaný vzorek slin do sterilní plastové nádobky o průměru 10 cm (alespoň 2 ml vzorku) slintáním, aby se zabránilo rozlití sekretů bronchiálního původu. Tyto tři vzorky budou okamžitě skladovány při -80ºC ve vzduchotěsných sáčcích, dokud nebudou odeslány do laboratoře. Pro analýzu vzorků budou všechny sekundární nádobky vzduchotěsných sáčků se třemi vzorky slin každého pacienta vloženy do pevné krabice se suchým ledem podle norem UN3733 a odeslány do laboratoře (FISABIO) kurýrní službou.

Při příjmu vzorků v Nadaci FISABIO budou zpracovány v zařízeních bezpečnostní laboratoře 3. úrovně následovně. Po rozmrazení vzorků při pokojové teplotě se odebere alikvot 200 ul pro extrakci RNA a zbytek se rozdělí na alikvoty a okamžitě se uloží při -80 °C pro testování v buněčných liniích.

Extrakce RNA bude provedena na plně automatizované platformě eMAG (bioMérieux, Francie) podle pokynů výrobce pro vzorky slin. Jednokroková rRT-PCR a amplifikace SARSCoV-2 budou provedeny, jak je popsáno výše.

Pro buněčnou kulturu se buňky Vero-E6 (ATCC) kultivují v DMEM doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS), 1% penicilin/streptomycin (P/S), 1% neesenciální aminokyseliny, 1 % L-glutaminu a 25 mM HEPES. Všechny buňky se inkubují při 37 °C a 5 % CO2.

Vzorky slin budou naředěny 1:1 v 1X Dulbeccově PBS. 300 ul zředěných vzorků slin bude inkubováno po dobu jedné hodiny při 37 °C a 5% CO2 s 1,5x105 Vero-E6 buňkami na 24jamkové destičce. Nenavázaný virus bude extrahován a médium nahrazeno 500 ul infekčního média (DMEM s 2 % FBS, 1 % penicilin/streptomycin (P/S), 1 % neesenciální aminokyseliny, 1 % L-glutamin, 25 mM HEPES a Tripsin TPCK 6 ug/ml). Infikované buňky Vero-E6 budou inkubovány při 37 °C a 5 % CO2. Po 5 dnech infekce bude supernatant odebrán pro extrakci RNA podle instrukcí platformy eMAG a provede se jednokroková rRT-PCR pro amplifikaci SARSCoV-2. Virová nálož získaná po tomto 5denním infekčním období bude považována za infekční virovou nálož.