Antyseptyczne płyny do płukania jamy ustnej w celu zmniejszenia miana wirusa w ślinie u pacjentów z COVID-19 (BUCOSARS)

Strategie zmniejszające miano wirusa w ślinie mogą przyczynić się do zmniejszenia ryzyka przenoszenia SARS-CoV-2. Zatem stosowanie płynów do płukania jamy ustnej z antyseptykami o działaniu wirusobójczym może być prostą i tanią strategią zapobiegawczą, którą można z łatwością zastosować w populacji ogólnej. Aby ocenić wpływ kilku środków antyseptycznych na neutralizację lub zmniejszenie miana wirusa SARS-CoV-2 in vivo w próbkach śliny, zaprojektowano wieloośrodkowe, randomizowane, ślepe, kontrolowane placebo badanie z pięcioma równoległymi grupami.

Badanie zostanie przeprowadzone w regionach Madrytu, Walencji i Murcji w Hiszpanii, w pięciu różnych szpitalach: Szpital Uniwersytecki Fundación Jiménez Díaz (Madryt, Hiszpania), Szpital Uniwersytecki Villalba (Madryt, Hiszpania), Szpital Uniwersytecki Infanta Elena (Madryt, Hiszpania) , Szpital Uniwersytecki Virgen de la Arixaca (Murcja, Hiszpania) oraz Szpital Uniwersytecki Clínico de Valencia (Walencja, Hiszpania).

Każdy włączony pacjent jest wcześniej diagnozowany i hospitalizowany z powodu zakażenia wirusem SARS-COV-2, przyjmowany głównie z powodu patologii układu oddechowego. Wszyscy będą pełnoletni (wiek >18 lat) i wyrażą dobrowolną pisemną lub ustną zgodę na udział zgodnie z zaleceniami szpitalnej komisji etycznej.

Po zatwierdzeniu zgody personel szpitala odpowiedzialny za interwencje będzie przydzielał kolejno każdemu uczestnikowi kod zgodnie z kolejnością z wcześniej wygenerowanej losowo tabeli. Kod będzie się składał z numeru pacjenta i litery odpowiadającej jednej z pięciu grup badawczych (A, B, C, D i E), która będzie znana personelowi klinicznemu, ale nieznana personelowi laboratorium, który będzie przetwarzał próbki i ekstrakcji RNA, jak również do tych, które będą analizować dane. W ten sposób uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do jednej z pięciu grup terapeutycznych, a zaślepienie zostanie osiągnięte poprzez użycie identycznych probówek o tej samej objętości zarówno dla płynów do płukania jamy ustnej, jak i placebo.

Każdy włączony pacjent jest proszony o powstrzymanie się od jedzenia, picia czegokolwiek poza wodą, żucia gumy, palenia, mycia zębów lub używania jakichkolwiek płynów do płukania jamy ustnej przez godzinę przed pobraniem próbki. Ponadto nie wolno im pić przez pół godziny po płukaniu jamy ustnej i jeść przez cały test.

Randomizowano pięć płynów do płukania ust: 2% powidon-jod (grupa A), 1% nadtlenek wodoru (grupa B), 0,12% chlorheksydyna (grupa C), 0,07% chlorek cetylopirydyniowy (grupa D) i woda destylowana (grupa E), jako Grupa kontrolna. Płukanki grupy C (Clorhexidina dental PHB©) i D (Vitis Xtra Forte©) są gotowe do użycia w swoich recepturach handlowych. W przypadku płynów do płukania jamy ustnej A i B stężenia należy dostosować do wskazanych wcześniej, rozcieńczając receptury handlowe wodą destylowaną na kilka minut przed płukaniem (3 ml 10% powidonu jodowanego do stosowania doustnego z 12 ml wody destylowanej, w grupa A i 5 ml nadtlenku wodoru 3%-Oximen® z 10 ml wody destylowanej, grupa B). Wszystkie płyny do płukania jamy ustnej i ich rozcieńczenia są produktami handlowymi sklasyfikowanymi jako bezpieczne.

Od każdego pacjenta zostaną pobrane łącznie 4 próbki śliny niestymulowanej: jedna podstawowa i trzy po płynie do płukania jamy ustnej, odpowiednio po 30 minutach, 60 minutach i 120 minutach. Pacjenci zostaną poproszeni o podanie każdej niestymulowanej próbki śliny do sterylnego plastikowego pojemnika o średnicy 10 cm (co najmniej 0,5 ml próbki) przez ślinienie, unikając rozlewania wydzieliny pochodzenia oskrzelowego. Natychmiast po każdym pobraniu próbki 0,5 ml śliny zostanie przeniesione do sterylnej probówki Eppendorfa zawierającej 1,5 ml buforu inaktywującego wirusy, oznaczonego kodem pacjenta i czasem pobrania próbki, i przechowywane w temperaturze 4°C. Cztery probówki Eppendorfa na pacjenta zostaną umieszczone w hermetycznej torbie zawierającej materiał absorbujący chroniący na wypadek niepożądanego otwarcia lub pęknięcia. Pojemniki wtórne zostaną umieszczone w sztywnym pudełku zgodnie z normami UN3733 i wysłane do laboratorium firmą kurierską w celu analizy.

Porcja 1 ml każdej próbki śliny rozcieńczona w buforze inaktywującym wirusy w proporcji 1:3 zostanie użyta do ekstrakcji RNA przy użyciu standardowej metody opartej na TRIzolu. Pokrótce, dodaje się 3 ml TRIzolu i 600 ul chloroformu, energicznie worteksuje przez 15 sekund i inkubuje na lodzie przez 10 minut. Następnie próbki będą wirowane przy 12 000 g przez 15 min w 4°C i faza wodna przeniesiona do dwóch czystych mikroprobówek z 750 ul izopropanolu. Probówki zostaną wymieszane przez odwrócenie i inkubowane przez 15 minut przed wirowaniem przy 12 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant zostanie odrzucony przez dekantację, a osad przemyte 1 ml 80% zimnego etanolu, worteksowane w celu dokładnego wymieszania i odwirowane przy 7500 g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty zostaną ostrożnie odessane i odrzucone, a osady wysuszone w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed ponownym zawieszeniem w 15 ul wody wolnej od RNAzy i zebrane w jednej probówce.

Jednoetapowy rRT-PCR zostanie przeprowadzony przy użyciu systemu SuperScript™ III One-Step RT-PCR System z polimerazą Platinum™ Taq DNA (Invitrogen-12574026) zgodnie z instrukcjami producenta. W celu amplifikacji genu SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay) zostanie przeprowadzony PCR zgodnie z protokołem Charité-Berlin na platformie LightCycler 480 2.0 (Roche). W tej samej serii próbki zostaną zamplifikowane za pomocą starterów RNP (rybonukleazy P) ludzkiego genu podstawowego w celu oceny jakości próbki. Wszystkie próbki zostaną poddane analizie w dwóch powtórzeniach, razem ze znaną wcześniej kontrolą pozytywną i negatywną. Kopie wirusa będą oznaczane ilościowo przy użyciu krzywej standardowej 10-krotnego rozcieńczenia wcześniej wygenerowanych transkryptów RNA (standard EDX SARS-CoV-2, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Kopie wirusa normalizowano przez ml śliny.

Jeśli chodzi o analizy, które mają zostać przeprowadzone, głównym celem badania jest określenie wpływu różnych płynów do płukania jamy ustnej na miano wirusa SARS-Cov2 w ślinie testowanej in vivo. Zatem głównym wynikiem będzie zmiana miana wirusa w ślinie między wartością wyjściową a trzema punktami czasowymi po płukaniu jamy ustnej w każdym leczeniu. Ponadto zbadane zostaną korelacje między podstawowym miano wirusa przed płukaniem a różnymi zebranymi danymi klinicznymi, takimi jak wiek, płeć, dni od pojawienia się objawów i dni od obecności wirusa u pacjentów, określone metodą PCR próbek z jamy nosowo-gardłowej . Na koniec ocenione zostaną możliwe powiązania między kategorialnymi zmiennymi klinicznymi a częstością pacjentów, u których następuje poprawa miana wirusa w różnym czasie dla różnych terapii.

Biorąc pod uwagę, że każdy ochotnik działa jako własna kontrola, przy porównywaniu wartości miana wirusa w ślinie za każdym razem w odniesieniu do poziomów przed płukaniem ust płynem do płukania jamy ustnej, wielkość próby 15 pacjentów na gałąź uznano za wystarczającą do zidentyfikowania znaczących różnic miana wirusa ponad 20% między punktami czasowymi, zakładając 10% utratę pacjentów z powodu porzucenia lub niskiego miana wirusa i przyjmując alfa 0,05 i moc 0,8. Ponieważ w badaniu zaprogramowano 5 oddziałów (powidon-jod, nadtlenek wodoru, chlorheksydyna, chlorek cetylopirydyniowy i kontrola), 75 pacjentów stanowiło minimalną całkowitą liczbę osób do zrekrutowania, które zostaną rozdzielone między różne szpitale.

Test rang ze znakiem Wilcoxona zostanie użyty do przetestowania średnich różnic, zarówno dla sparowanego przypadku (przy porównywaniu obserwacji w różnych punktach czasowych dla tych samych osobników), jak i dla przypadku niesparowanego (podczas porównywania różnych zabiegów opartych na względnych zmianach miano wirusa). Ponadto zostaną przeprowadzone niektóre testy związku między sparowanymi próbkami przy użyciu współczynników korelacji Spearmana w celu oceny związku między wiremią a innymi ciągłymi zmiennymi klinicznymi. Wreszcie, w celu oceny powiązań między klinicznymi zmiennymi kategorycznymi a częstością osób reagujących/niereagujących na leczenie, badacze przeprowadzą testy tabeli kontyngencji chi-kwadrat. Badacze określają jako osobę reagującą osobę wykazującą poprawę równą lub większą niż 90% podstawowego miana wirusa. Wszystkie obliczenia i testy zostaną wykonane przy użyciu środowiska R do obliczeń statystycznych w wersji 3.6.3 i jego pakiet „stats” [R Core Team 2020].

Ponadto, aby określić wpływ płynów do płukania jamy ustnej na żywotność wirusów w ślinie, do szpitalnej komisji etycznej przedłożono załącznik, a po jego zatwierdzeniu do badania zrekrutowano kolejnych 62 pacjentów. W tym przypadku protokół zawierał szereg modyfikacji, a mianowicie: (i) wykorzystanie tylko próbek podstawowych, 30-minutowych i 60-minutowych (z wyłączeniem próbek 2-godzinnych); (ii) nieużywania buforu inaktywującego wirusy w celu zapewnienia żywotności wirusa; (iii) test zakażenia in vitro w celu określenia zdolności zakaźnej wirusów śliny (infekcyjne miano wirusa), co zostało uwzględnione jako dodatkowy wynik. Szczegóły opisano poniżej.

Badanie zostanie przeprowadzone w regionach Madrytu, Walencji i Murcji w Hiszpanii, w czterech różnych szpitalach: Szpital Uniwersytecki Fundación Jiménez Díaz (Madryt, Hiszpania), Szpital Uniwersytecki Villalba (Madryt, Hiszpania), Szpital Uniwersytecki Infanta Elena (Madryt, Hiszpania) oraz Szpital Uniwersytecki Virgen de la Arixaca (Murcia, Hiszpania).

Od każdego pacjenta zostaną pobrane łącznie 3 próbki śliny niestymulowanej: jedna podstawowa i dwie po płukaniu jamy ustnej, odpowiednio po 30 minutach i 60 minutach. Pacjenci zostaną poproszeni o podanie każdej niestymulowanej próbki śliny do sterylnego plastikowego pojemnika o średnicy 10 cm (co najmniej 2 ml próbki) przez ślinienie, unikając rozlewania wydzieliny pochodzenia oskrzelowego. Trzy próbki będą natychmiast przechowywane w temperaturze -80ºC w hermetycznych torebkach do czasu wysłania ich do laboratorium. W celu analizy próbek, wszystkie dodatkowe pojemniki hermetycznych worków z trzema próbkami śliny każdego pacjenta zostaną umieszczone w sztywnym pudełku z suchym lodem zgodnie z normami UN3733 i wysłane do laboratorium (FISABIO) przez firmę kurierską.

Po otrzymaniu próbek w Fundacji FISABIO będą one przetwarzane w obiektach laboratorium bezpieczeństwa poziomu 3 w następujący sposób. Po rozmrożeniu próbek w temperaturze pokojowej, 200 ul zostanie pobrane do ekstrakcji RNA, a reszta zostanie podzielona na porcje i natychmiast przechowywana w temperaturze -80°C do analizy w liniach komórkowych.

Ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona za pomocą w pełni zautomatyzowanej platformy eMAG (bioMérieux, Francja) zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek śliny. Jednoetapowy rRT-PCR i amplifikacja SARSCoV-2 zostaną przeprowadzone jak opisano powyżej.

Do hodowli komórek komórki Vero-E6 (ATCC) hoduje się w DMEM uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną (P/S), 1% aminokwasami nieistotnymi, 1 % L-glutaminy i 25 mM HEPES. Wszystkie komórki inkubuje się w 37°C i 5% CO2.

Próbki śliny zostaną rozcieńczone 1:1 w 1X PBS Dulbecco. 300 ul rozcieńczonych próbek śliny będzie inkubowane przez jedną godzinę w 37°C i 5% CO2 z 1,5x105 komórek Vero-E6 w 24-studzienkowej płytce. Niezwiązany wirus zostanie wyekstrahowany, a pożywka zastąpiona 500 ul pożywki infekcyjnej (DMEM z 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 1% nieistotnych aminokwasów, 1% L-glutaminy, 25 mM HEPES i Tripsine TPCK 6ug/ml). Zainfekowane komórki Vero-E6 będą inkubowane w 37°C i 5% CO2. Po 5 dniach infekcji supernatant zostanie pobrany w celu ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami platformy eMAG i przeprowadzonego jednoetapowego rRT-PCR w celu amplifikacji SARSCoV-2. Miano wirusa uzyskane po tym 5-dniowym okresie infekcji będzie uważane za miano wirusa zakaźnego.