Enxaguantes bucais antissépticos para reduzir a carga viral salivar em pacientes com COVID-19 (BUCOSARS)

Estratégias de redução da carga viral salivar podem contribuir para reduzir o risco de transmissão do SARS-CoV-2. Assim, o uso de bochechos com antissépticos com atividade virucida pode ser uma estratégia preventiva simples e de baixo custo, podendo ser facilmente aplicada na população em geral. Para avaliar o efeito de vários antissépticos para neutralizar ou reduzir a carga viral de SARS-CoV-2 in vivo em amostras de saliva, foi desenvolvido um estudo multicêntrico, randomizado, cego, com cinco grupos paralelos e controlado por placebo.

O estudo será realizado nas regiões de Madri, Valência e Múrcia na Espanha, em cinco hospitais diferentes: Hospital Universitário Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espanha), Hospital Geral Universitário Villalba (Madrid, Espanha), Hospital Universitário Infanta Elena (Madrid, Espanha) , Hospital Universitário Virgen de la Arixaca (Murcia, Espanha) e Hospital Universitário Clínico de Valencia (Valência, Espanha).

Todos os pacientes incluídos são previamente diagnosticados e internados por infecção por SARS-COV-2, sendo internados principalmente por patologia respiratória. Todos eles serão adultos (idade > 18 anos) e fornecerão seu consentimento voluntário por escrito ou oral para participação de acordo com as recomendações do comitê de ética do hospital.

Após a aprovação do consentimento, a equipe do hospital responsável pelas intervenções atribuirá consecutivamente a cada participante um código seguindo a ordem de uma tabela previamente gerada aleatoriamente. O código será composto por um número de paciente e uma letra correspondente a um dos cinco grupos de estudo (A, B, C, D e E), que serão conhecidos do pessoal clínico, mas desconhecidos do pessoal do laboratório que irá processar as amostras e extrair RNA, bem como para aqueles que irão analisar os dados. Desta forma, os participantes serão aleatoriamente designados para um dos cinco grupos de tratamento e o cego será obtido usando tubos idênticos com o mesmo volume para enxaguatórios bucais e placebo.

Todos os pacientes incluídos são orientados a não comer, beber nada além de água, mascar chiclete, fumar, escovar os dentes ou usar qualquer enxaguante bucal por uma hora antes da coleta da amostra. Além disso, eles não podem beber por meia hora após o bochecho e comer durante todo o teste.

Cinco enxaguatórios bucais são randomizados: iodopovidona 2% (grupo A), peróxido de hidrogênio 1% (grupo B), clorexidina 0,12% (grupo C), cloreto de cetilpiridínio 0,07% (grupo D) e água destilada (grupo E), como o grupo de controle. Os enxágues do grupo C (Clorhexidina dental PHB©) e D (Vitis Xtra Forte©) estão prontos para uso em suas fórmulas comerciais. No caso dos colutórios A e B, as concentrações devem ser ajustadas às previamente indicadas diluindo as fórmulas comerciais com água destilada minutos antes do enxágue (3 mL de iodopovidona 10% para uso oral com 12 mL de água destilada, em grupo A e 5 mL de peróxido de hidrogênio 3%-Oximen© com 10 mL de água destilada, no grupo B). Todos os enxaguatórios bucais e suas respectivas diluições são produtos comerciais classificados como seguros.

Um total de 4 amostras de saliva não estimulada serão coletadas para cada paciente: uma basal e três após o bochecho, aos 30 minutos, aos 60 minutos e aos 120 minutos, respectivamente. Os pacientes serão solicitados a fornecer cada amostra de saliva não estimulada em um recipiente plástico estéril de 10 cm de diâmetro (pelo menos 0,5 mL de amostra) por meio de salivação, evitando o derramamento de secreções de origem brônquica. Imediatamente após cada amostragem, 0,5 mL de saliva será transferido para um tubo Eppendorf estéril com 1,5 mL de tampão inativador de vírus marcado com o código do paciente e tempo de amostra e mantido a 4 °C. Os quatro tubos Eppendorf por paciente serão introduzidos em bolsa hermética, contendo material absorvente protetor em caso de abertura indesejada ou quebra. Os recipientes secundários serão introduzidos em uma caixa rígida de acordo com as normas UN3733 e enviados ao laboratório por serviço de correio para análise.

Uma alíquota de 1 ml de cada amostra de saliva diluída em tampão inativador de vírus na proporção 1:3 será utilizada para extração de RNA pelo método padrão baseado em TRIzol. Resumidamente, serão adicionados 3 ml de TRIzol e 600 ul de clorofórmio, agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados em gelo por 10 minutos. Em seguida, as amostras serão centrifugadas a 12.000 g por 15 min a 4 °C e a fase aquosa transferida para dois microtubos limpos com 750 ul de isopropanol. Os tubos serão misturados por inversão e incubados durante 15 minutos antes da centrifugação a 12.000 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante será descartado por decantação e os pellets lavados com 1 ml de etanol 80% frio, agitados no vórtex para misturar bem e centrifugados a 7.500 g por 5 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes serão cuidadosamente aspirados e descartados, e os pellets secos à temperatura ambiente por 10 minutos antes de serem ressuspensos em 15 ul de água livre de RNAse e reunidos em um único tubo.

A rRT-PCR de uma etapa será realizada usando o sistema SuperScript™ III One-Step RT-PCR com Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen-12574026) de acordo com as instruções do fabricante. Para a amplificação do gene SARSCoV-2 E (ensaio de triagem de betacoronavírus), a PCR será realizada seguindo o protocolo Charité-Berlin em uma plataforma LightCycler 480 2.0 (Roche). Na mesma corrida, as amostras serão amplificadas com primers RNP (Ribonuclease P) do gene humano para avaliar a qualidade da amostra. Todas as amostras serão processadas em duas repetições, juntamente com controles positivos e negativos previamente conhecidos. As cópias do vírus serão quantificadas usando uma curva padrão de diluição de 10 vezes de transcritos de RNA previamente gerados (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). As cópias do vírus foram normalizadas por ml de saliva.

Em relação às análises a serem realizadas, o principal objetivo do estudo é determinar o efeito dos diferentes colutórios na carga viral SARS-Cov2 na saliva testada in vivo. Assim, o resultado primário será a mudança na carga viral salivar entre a linha de base e os três momentos pós-bochechos em cada tratamento. Além disso, também serão estudadas as correlações entre a carga viral basal antes do bochecho com os diferentes dados clínicos coletados, como idade, sexo, dias desde o início dos sintomas e dias desde a positividade do vírus dos pacientes determinada por PCR de amostras nasofaríngeas . Finalmente, serão avaliadas as possíveis associações entre variáveis ​​clínicas categóricas e a frequência de pacientes que melhoram da carga viral em diferentes momentos para os diferentes tratamentos.

Considerando que cada voluntário atua como seu próprio controle, ao comparar os valores de carga viral na saliva a cada momento com relação aos níveis antes do bochecho com enxaguatório, um tamanho de amostra de 15 pacientes por ramo foi considerado suficiente para identificar diferenças significativas de carga viral de mais de 20% entre os momentos, assumindo uma perda de 10% de pacientes por abandono ou baixa carga viral e adotando um alfa de 0,05 e um poder de 0,8. Como foram programados 5 ramos no ensaio (povidona-iodo, peróxido de hidrogênio, clorexidina, cloreto de cetilpiridínio e o controle), 75 pacientes foram o número mínimo de indivíduos totais a serem recrutados, que serão distribuídos entre os diferentes hospitais.

Será utilizado um teste de postos sinalizados de Wilcoxon para testar as diferenças de médias, tanto para o caso pareado, (ao comparar observações em diferentes pontos de tempo para os mesmos indivíduos), quanto para o caso não pareado (ao comparar diferentes tratamentos baseados em mudanças relativas de carga viral). Além disso, alguns testes de associação entre amostras pareadas usando coeficientes de correlação de Spearman serão realizados para avaliar a relação entre a carga viral e outras variáveis ​​clínicas contínuas. Finalmente, para avaliar associações entre variáveis ​​clínicas categóricas e a frequência de respondedores/não respondedores aos tratamentos, os investigadores realizarão testes de tabela de contingência do qui-quadrado. Os investigadores definem como respondedor um indivíduo que apresenta uma melhoria igual ou superior a 90% da carga viral basal. Todos os cálculos e testes serão realizados usando o ambiente R para computação estatística versão 3.6.3 e seu pacote de 'stats' [R Core Team 2020].

Além disso, para determinar o efeito dos enxaguatórios bucais na viabilidade dos vírus na saliva, um adendo foi submetido ao comitê de ética do hospital e, após sua aprovação, mais 62 pacientes foram recrutados para o estudo. Neste caso, o protocolo incluiu algumas modificações, nomeadamente: (i) a utilização apenas de amostras basais, de 30 minutos e de 60 minutos (excluídas as amostras de 2 horas); (ii) não usar tampão de inativação de vírus para garantir a viabilidade viral; (iii) um ensaio de infecção in vitro para determinar a capacidade infecciosa dos vírus salivares (carga viral infecciosa), que foi incluído como um resultado adicional. Os detalhes são descritos abaixo.

O estudo será realizado nas regiões de Madri, Valência e Múrcia na Espanha, em quatro hospitais diferentes: Hospital Universitário Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espanha), Hospital Geral Universitário Villalba (Madrid, Espanha), Hospital Universitário Infanta Elena (Madrid, Espanha) e Hospital Universitário Virgen de la Arixaca (Múrcia, Espanha).

Um total de 3 amostras de saliva não estimulada serão coletadas para cada paciente: uma basal e duas após o bochecho, aos 30 minutos e aos 60 minutos, respectivamente. Os pacientes serão solicitados a fornecer cada amostra de saliva não estimulada em um recipiente plástico estéril de 10 cm de diâmetro (pelo menos 2 mL de amostra) por meio da salivação, evitando o derramamento de secreções de origem brônquica. As três amostras serão imediatamente armazenadas a -80ºC em sacos herméticos até o envio ao laboratório. Para análise das amostras, todos os recipientes secundários de bolsas herméticas com as três amostras de saliva de cada paciente serão introduzidos em uma caixa rígida com gelo seco de acordo com as normas UN3733 e enviados ao laboratório (FISABIO) por serviço de correio.

Ao receber as amostras na Fundação FISABIO, elas serão processadas nas instalações do laboratório de segurança nível 3, conforme segue. Após o descongelamento das amostras em temperatura ambiente, uma alíquota de 200 uL será retirada para extração do RNA, e o restante será aliquotado e imediatamente armazenado a -80C para análise em linhagens celulares.

A extração de RNA será realizada com a plataforma totalmente automatizada eMAG (bioMérieux, França) seguindo as instruções do fabricante para amostras de saliva. Uma etapa rRT-PCR e a amplificação do SARSCoV-2 serão realizadas conforme descrito acima.

Para a cultura celular, as células Vero-E6 (ATCC) são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 1% de Penicilina/Estreptomicina (P/S), 1% de aminoácidos não essenciais, 1 % L-glutamina e HEPES 25mM. Todas as células são incubadas a 37°C e 5% de CO2.

As amostras de saliva serão diluídas 1:1 em 1X Dulbecco's PBS. 300 ul de amostras de saliva diluídas serão incubadas por uma hora a 37°C e 5% de CO2 com 1,5x105 células Vero-E6 em uma placa de 24 poços. O vírus não ligado será extraído e o meio substituído por 500 ul de meio de infecção (DMEM com 2% FBS, 1% Penicilina/Estreptomicina (P/S), 1% aminoácidos não essenciais, 1% L-glutamina, 25mM HEPES e Tripsina TPCK 6ug/ml). As células Vero-E6 infectadas serão incubadas a 37°C e 5% de CO2. Após 5 dias de infecção, o sobrenadante será coletado para extração de RNA seguindo as instruções da plataforma eMAG e uma etapa de rRT-PCR será realizada para a amplificação do SARSCoV-2. A carga viral obtida após este período de infecção de 5 dias será considerada a carga viral infecciosa.