Antiseptiske munnskyllinger for å redusere spyttvirusbelastningen hos COVID-19-pasienter (BUCOSARS)

Strategier som reduserer spyttvirusmengden kan bidra til å redusere risikoen for overføring av SARS-CoV-2. Dermed kan bruk av munnvann med antiseptika som har virucidal aktivitet være en enkel og rimelig forebyggende strategi som lett kan brukes i befolkningen generelt. For å evaluere effekten av flere antiseptika for å nøytralisere eller redusere SARS-CoV-2-virusmengden in vivo i spyttprøver, er det designet en multisenter, randomisert, blind, fem-parallellgruppe, placebokontrollert studie.

Studien vil bli utført i Madrid, Valencia og Murcia-regionene i Spania, på fem forskjellige sykehus: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spania), Villalba University General Hospital (Madrid, Spania), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spania) , Virgen de la Arixaca universitetssykehus (Murcia, Spania) og Clínico de Valencia universitetssykehus (Valencia, Spania).

Hver pasient inkludert er tidligere diagnostisert og innlagt på sykehus på grunn av SARS-COV-2-infeksjon, og blir hovedsakelig innlagt for respiratorisk patologi. Alle vil være voksne (alder >18 år) og gi sitt frivillige skriftlige eller muntlige samtykke til deltakelse i henhold til anbefalinger fra sykehusets etiske komité.

Etter godkjenning av samtykke vil sykehuspersonalet som er ansvarlig for intervensjonene fortløpende tildele hver deltaker en kode etter ordre fra en tidligere tilfeldig generert tabell. Koden vil bestå av et pasientnummer og en bokstav som tilsvarer en av de fem studiegruppene (A, B, C, D og E), som vil være kjent for det kliniske personalet, men ukjent for laboratoriepersonellet som skal behandle prøver og ekstrahere RNA, så vel som til de som skal analysere dataene. På denne måten vil deltakerne bli tilfeldig fordelt i en av de fem behandlingsgruppene og blinde oppnås ved å bruke identiske rør med samme volum for både munnvann og placebo.

Alle inkluderte pasienter blir bedt om å ikke spise, drikke annet enn vann, tygge tyggegummi, røyke, pusse tenner eller bruke munnvann i én time før prøvetaking. I tillegg får de ikke drikke på en halvtime etter munnvannet og spise hele testen.

Fem munnvann er randomisert: 2 % povidon-jod (gruppe A), 1 % hydrogenperoksid (gruppe B), 0,12 % klorheksidin (gruppe C), 0,07 % cetylpyridiniumklorid (gruppe D) og destillert vann (gruppe E), som kontrollgruppe. Gruppe C (Clorhexidina dental PHB©) og D (Vitis Xtra Forte©) skyllinger er klare til bruk i sine kommersielle formler. Når det gjelder munnvann A og B, må konsentrasjonene justeres til de som tidligere er angitt ved å fortynne kommersielle formler med destillert vann minutter før skylling (3 ml povidon-jod 10 % for oral bruk med 12 ml destillert vann, i gruppe A og 5 ml hydrogenperoksyd 3 % - Oximen© med 10 ml destillert vann, i gruppe B). Alle munnvann og deres respektive fortynninger er kommersielle produkter klassifisert som trygge.

Totalt 4 ikke-stimulerte spyttprøver vil bli samlet inn for hver pasient: en basal og tre etter munnskyllevannet, henholdsvis 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter. Pasientene vil bli bedt om å gi hver ustimulert spyttprøve i en steril plastbeholder på 10 cm i diameter (minst 0,5 ml prøve) ved å sikle, og unngå å søle sekret av bronkial opprinnelse. Umiddelbart etter hver prøvetaking vil 0,5 ml spytt overføres til et sterilt Eppendorf-rør med 1,5 ml virusinaktiverende buffer merket med pasientkode og prøvetid og holdes ved 4 °C. De fire Eppendorf-rørene per pasient vil bli introdusert i en lufttett pose, som inneholder beskyttende absorberende materiale i tilfelle uønsket åpning eller brudd. De sekundære beholderne vil bli introdusert i en stiv boks i henhold til UN3733 standarder og sendt til laboratoriet med budtjeneste for analyse.

En alikvot på 1 ml av hver spyttprøve fortynnet i den virusinaktiverende bufferen i forhold 1:3, vil bli brukt til RNA-ekstraksjon ved bruk av en standard TRIzol-basert metode. Kort fortalt vil 3 ml TRIzol og 600 ul kloroform tilsettes, vortex kraftig i 15 sekunder og inkuberes på is i 10 minutter. Deretter vil prøvene sentrifugeres ved 12 000 g i 15 minutter ved 4 ° C og den vandige fasen overføres til to rene mikrorør med 750 ul isopropanol. Rørene vil bli blandet ved inversjon og inkubert i 15 minutter før sentrifugering ved 12 000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten vil bli kastet ved dekantering og pellets vasket med 1 ml 80 % kald etanol, vortexet for å blandes grundig og sentrifugert ved 7500 g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanter vil bli forsiktig aspirert og kastet, og pellets tørkes ved romtemperatur i 10 minutter før de resuspenderes i 15 ul RNAse-fritt vann og samles i et enkelt rør.

Ett-trinns rRT-PCR vil bli utført med SuperScript™ III One-Step RT-PCR-system med Platinum™ Taq DNA-polymerase (Invitrogen-12574026) i henhold til produsentens instruksjoner. For amplifisering av SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay)-genet, vil PCR bli utført etter Charité-Berlin-protokollen i en LightCycler 480 2.0 (Roche)-plattform. I samme kjøring vil prøvene bli amplifisert med husholdnings-human-gen RNP (Ribonuclease P)-primere for å vurdere prøvekvaliteten. Alle prøver vil bli kjørt i to replikater, sammen med en tidligere kjent positiv og negativ kontroll. Viruskopier vil kvantifiseres ved å bruke en 10-gangers fortynningsstandardkurve av RNA-transkripter tidligere generert (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Viruskopier ble normalisert med ml spytt.

Når det gjelder analysene som skal utføres, er hovedmålet med studien å bestemme effekten av de forskjellige munnvannene på SARS-Cov2 virusmengden i spytt testet in vivo. Det primære resultatet vil derfor være endringen i spyttvirusmengden mellom baseline og de tre post-munnskylletidspunktene i hver behandling. I tillegg vil korrelasjonene mellom den basale virusmengden før skylling med de forskjellige kliniske dataene som er samlet inn, som alder, kjønn, dager siden symptomene og dager siden pasientenes viruspositivitet bestemt ved PCR av nasofaryngeale prøver også bli studert. . Til slutt vil de mulige assosiasjonene mellom kategoriske kliniske variabler og hyppigheten av pasienter som forbedrer seg i viral belastning på ulike tidspunkter for de ulike behandlingene bli evaluert.

Tatt i betraktning at hver frivillig fungerer som sin egen kontroll, ved sammenligning av viral belastningsverdier i spytt til enhver tid med hensyn til nivåene før skylling med munnvann, ble en prøvestørrelse på 15 pasienter per gren ansett som tilstrekkelig til å identifisere signifikante forskjeller i viral belastning på mer enn 20 % mellom tidspunktene, forutsatt et 10 % tap av pasienter på grunn av oppgivelse eller lav virusmengde og ved å ta i bruk en alfa på 0,05 og en potens på 0,8. Ettersom 5 grener ble programmert i forsøket (povidon-jod, hydrogenperoksid, klorheksidin, cetylpyridiniumklorid og kontrollen), var 75 pasienter minimum antall individer som skulle rekrutteres, som vil bli fordelt på de forskjellige sykehusene.

En Wilcoxon signed-rank test vil bli brukt for å teste gjennomsnittlige forskjeller, både for det sammenkoblede tilfellet (når man sammenligner observasjoner på forskjellige tidspunkt for de samme individene), og for det ikke-parede tilfellet (når man sammenligner ulike behandlinger basert på relative endringer av viral belastning). I tillegg vil noen tester for assosiasjon mellom sammenkoblede prøver ved bruk av Spearmans korrelasjonskoeffisienter bli utført for å vurdere forholdet mellom viral belastning og andre kliniske kontinuerlige variabler. Til slutt, for å evaluere assosiasjoner mellom kliniske kategoriske variabler og frekvensen av respondere/ikke-respondere på behandlingene, vil etterforskerne utføre chi-kvadratberedskapstabelltester. Etterforskerne definerer som responder et individ som viser en forbedring lik eller større enn 90 % av basal viral belastning. Alle beregninger og tester vil bli utført ved å bruke R-miljøet for statistisk databehandling versjon 3.6.3 og dens 'statistikk'-pakke [R Core Team 2020].

I tillegg, for å fastslå effekten av munnskyllene på levedyktigheten til virusene i spytt, ble det sendt et tillegg til sykehusets etiske komité, og etter godkjenning ble 62 flere pasienter rekruttert til studien. I dette tilfellet inkluderte protokollen en rekke modifikasjoner, nemlig: (i) bruk av kun basale prøver, 30 minutter og 60 minutter (ekskludert 2 timers prøver); (ii) ikke bruke virusinaktiverende buffer for å sikre viral levedyktighet; (iii) en in vitro-infeksjonsanalyse for å bestemme infeksjonskapasiteten til spyttvirusene (infeksiøs virusmengde), som er inkludert som et tilleggsresultat. Detaljene er beskrevet nedenfor.

Studien vil bli utført i Madrid, Valencia og Murcia-regionene i Spania, på fire forskjellige sykehus: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spania), Villalba University General Hospital (Madrid, Spania), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spania) og Virgen de la Arixaca universitetssykehus (Murcia, Spania).

Totalt 3 ikke-stimulerte spyttprøver vil bli samlet inn for hver pasient: en basal og to etter munnskyllevannet, henholdsvis 30 minutter og 60 minutter. Pasientene vil bli bedt om å gi hver ustimulert spyttprøve i en steril plastbeholder med en diameter på 10 cm (minst 2 ml prøve) ved å sikle, og unngå å søle sekret av bronkial opprinnelse. De tre prøvene vil umiddelbart lagres ved -80ºC i lufttette poser til de sendes til laboratoriet. For prøveanalyse vil alle sekundære beholdere med lufttette poser med de tre spyttprøvene til hver pasient bli introdusert i en stiv boks med tørris i henhold til UN3733-standarder og sendt til laboratoriet (FISABIO) med budtjeneste.

Ved mottak av prøvene hos FISABIO Foundation vil de bli behandlet i fasilitetene til nivå 3 sikkerhetslaboratoriet som følger. Etter opptining av prøvene ved romtemperatur, vil en 200 ul alikvot tas for RNA-ekstraksjon, og resten vil bli alikvotert og umiddelbart lagret ved -80C for analyse i cellelinjer.

RNA-ekstraksjon vil bli utført med den helautomatiserte plattformen eMAG (bioMérieux, Frankrike) etter produsentens instruksjoner for spyttprøver. Ett trinns rRT-PCR og amplifikasjonen av SARSCoV-2 vil bli utført som beskrevet ovenfor.

For cellekulturen dyrkes Vero-E6-celler (ATCC) i DMEM supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin og 25 mM HEPES. Alle celler inkuberes ved 37°C og 5 % CO2.

Spyttprøver vil bli fortynnet 1:1 i 1X Dulbeccos PBS. 300 ul av fortynnede spyttprøver vil bli inkubert i én time ved 37°C og 5 % CO2 med 1,5x105 Vero-E6-celler i en 24-brønns plate. Ubundet virus vil bli ekstrahert og mediet erstattet av 500 ul infeksjonsmedium (DMEM med 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 25 mM HEPES og Tripsine TPCK 6ug/ml). Infiserte Vero-E6-celler vil bli inkubert ved 37°C og 5 % CO2. Etter 5 dager med infeksjon vil supernatanten samles opp for RNA-ekstraksjon ved å følge instruksjonene for eMAG-plattformen, og ett trinns rRT-PCR utføres for amplifikasjon av SARSCoV-2. Virusmengden oppnådd etter denne 5-dagers infeksjonsperioden vil bli betraktet som den smittsomme virusmengden.