Антисептические полоскания рта для снижения вирусной нагрузки слюны у пациентов с COVID-19 (BUCOSARS)

Стратегии снижения вирусной нагрузки в слюне могут способствовать снижению риска передачи SARS-CoV-2. Таким образом, использование жидкостей для полоскания рта с антисептиками, обладающими вирулицидной активностью, может быть простой и недорогой профилактической стратегией, которую можно легко применять среди населения в целом. Чтобы оценить влияние нескольких антисептиков на нейтрализацию или снижение вирусной нагрузки SARS-CoV-2 in vivo в образцах слюны, было разработано многоцентровое рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование с пятью параллельными группами.

Исследование будет проводиться в регионах Мадрид, Валенсия и Мурсия в Испании, в пяти разных больницах: университетской больнице Fundación Jiménez Díaz (Мадрид, Испания), больнице общего профиля университета Вильяльба (Мадрид, Испания), университетской больнице Infanta Elena (Мадрид, Испания). , Университетская больница Вирхен-де-ла-Аришака (Мурсия, Испания) и Университетская больница Клинико-де-Валенсия (Валенсия, Испания).

Каждый включенный пациент ранее диагностирован и госпитализирован по поводу инфекции SARS-COV-2, госпитализирован в основном по поводу респираторной патологии. Все они будут взрослыми (возраст >18 лет) и предоставят свое добровольное письменное или устное согласие на участие в соответствии с рекомендациями комитета по этике больницы.

После утверждения согласия персонал больницы, ответственный за вмешательства, последовательно присваивает каждому участнику код в соответствии с порядком из ранее случайно сгенерированной таблицы. Код будет состоять из номера пациента и буквы, соответствующей одной из пяти групп исследования (A, B, C, D и E), которые будут известны клиническому персоналу, но неизвестны персоналу лаборатории, который будет обрабатывать образцы и извлечения РНК, а также к тем, которые будут анализировать данные. Таким образом, участники будут случайным образом распределены в одну из пяти групп лечения, а слепые будут достигнуты за счет использования идентичных пробирок с одинаковым объемом как для полоскания рта, так и для плацебо.

Каждого включенного пациента просят не есть, не пить ничего, кроме воды, жевать жевательную резинку, курить, чистить зубы или использовать какие-либо жидкости для полоскания рта в течение одного часа до сбора образцов. Кроме того, им нельзя пить в течение получаса после полоскания рта и есть на протяжении всего теста.

Рандомизированы пять жидкостей для полоскания рта: 2% повидон-йод (группа А), 1% перекись водорода (группа В), 0,12% хлоргексидин (группа С), 0,07% хлорид цетилпиридиния (группа D) и дистиллированная вода (группа Е). контрольная группа. Ополаскиватели групп C (Clorhexidinadental PHB©) и D (Vitis Xtra Forte©) готовы к использованию в коммерческих рецептурах. В случае ополаскивателей для полости рта A и B концентрации должны быть скорректированы до ранее указанных путем разбавления коммерческих составов дистиллированной водой за несколько минут до полоскания (3 мл 10% повидон-йода для перорального применения с 12 мл дистиллированной воды, в группа А и 5 мл перекиси водорода 3%-Оксимен © с 10 мл дистиллированной воды, группа Б). Все жидкости для полоскания рта и их соответствующие растворы являются коммерческими продуктами, классифицируемыми как безопасные.

Всего у каждого пациента будет взято 4 нестимулированных образца слюны: один исходный и три после полоскания рта, через 30 минут, через 60 минут и через 120 минут соответственно. Пациентов попросят предоставить каждый нестимулированный образец слюны в стерильный пластиковый контейнер диаметром 10 см (не менее 0,5 мл образца) путем слюнотечения, избегая проливания выделений бронхиального происхождения. Немедленно после каждого отбора 0,5 мл слюны переносят в стерильную пробирку Эппендорф с 1,5 мл инактивирующего вирус буфера, помеченного кодом пациента и временем отбора проб, и хранят при 4 °C. Четыре пробирки Эппендорф на каждого пациента будут помещены в герметичный пакет, содержащий защитный абсорбирующий материал на случай нежелательного вскрытия или поломки. Вторичные контейнеры будут упакованы в жесткую коробку в соответствии со стандартами UN3733 и отправлены в лабораторию курьерской службой для анализа.

Аликвоту по 1 мл каждого образца слюны, разведенную в инактивирующем вирус буфере в пропорции 1:3, используют для экстракции РНК стандартным методом на основе тризола. Вкратце, добавляют 3 мл TRIzol и 600 мкл хлороформа, энергично встряхивают в течение 15 секунд и инкубируют на льду в течение 10 минут. Затем образцы центрифугируют при 12 000 g в течение 15 минут при 4 °C, а водную фазу переносят в две чистые микропробирки с 750 мкл изопропанола. Пробирки перемешивают переворачиванием и инкубируют в течение 15 минут перед центрифугированием при 12 000 g в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант отбрасывают путем декантации, а осадки промывают 1 мл 80% холодного этанола, встряхивают для тщательного перемешивания и центрифугируют при 7500 g в течение 5 минут при 4 °C. Супернатанты осторожно отсасывают и отбрасывают, а осадки сушат при комнатной температуре в течение 10 минут перед ресуспендированием в 15 мкл воды, не содержащей РНКазы, и объединяют в одну пробирку.

Одноэтапная рОТ-ПЦР будет проводиться с использованием системы одноэтапной ОТ-ПЦР SuperScript™ III с ДНК-полимеразой Platinum™ Taq (Invitrogen-12574026) в соответствии с инструкциями производителя. Для амплификации гена SARSCoV-2 E (скрининг бета-коронавируса) ПЦР будет проводиться в соответствии с протоколом Charité-Berlin на платформе LightCycler 480 2.0 (Roche). В том же цикле образцы будут амплифицированы с помощью праймеров RNP (рибонуклеаза P) человеческого гена домашнего хозяйства для оценки качества образцов. Все образцы будут запускаться в двух повторностях вместе с ранее известными положительными и отрицательными контролями. Количество копий вируса будет определено с использованием стандартной кривой 10-кратного разведения ранее созданных транскриптов РНК (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Копии вируса нормализовали по мл слюны.

Что касается анализов, которые необходимо провести, то основной целью исследования является определение влияния различных жидкостей для полоскания рта на вирусную нагрузку SARS-Cov2 в слюне, протестированную in vivo. Таким образом, первичным результатом будет изменение вирусной нагрузки слюны между исходным уровнем и тремя временными точками после полоскания рта при каждом лечении. Кроме того, будут также изучены корреляции между базальной вирусной нагрузкой до промывания и различными собранными клиническими данными, такими как возраст, пол, количество дней с момента появления симптомов и дней с момента положительного ответа на вирус у пациентов, определенного с помощью ПЦР образцов из носоглотки. . Наконец, будут оценены возможные связи между категориальными клиническими переменными и частотой пациентов, у которых вирусная нагрузка улучшается в разное время для различных видов лечения.

Учитывая, что каждый доброволец выступает в качестве своего собственного контроля, при сравнении значений вирусной нагрузки в слюне в каждый момент времени по отношению к уровням до полоскания рта жидкостью для полоскания рта размер выборки в 15 пациентов на отделение считался достаточным для выявления значительных различий вирусной нагрузки. более 20% между временными точками, предполагая потерю 10% пациентов из-за отказа от лечения или низкой вирусной нагрузки и принимая альфа 0,05 и мощность 0,8. Поскольку в испытании было запрограммировано 5 отделений (повидон-йод, перекись водорода, хлоргексидин, хлорид цетилпиридиния и контроль), 75 пациентов были минимальным числом от общего числа лиц, которые должны быть набраны и распределены по разным больницам.

Критерий знакового ранга Уилкоксона будет использоваться для проверки средних различий как для парного случая (при сравнении наблюдений в разные моменты времени для одних и тех же лиц), так и для непарного случая (при сравнении различных методов лечения на основе относительных изменений вирусная нагрузка). Кроме того, будут проведены некоторые тесты на связь между парными образцами с использованием коэффициентов корреляции Спирмена для оценки взаимосвязи между вирусной нагрузкой и другими клиническими непрерывными переменными. Наконец, чтобы оценить взаимосвязь между клиническими категориальными переменными и частотой ответивших/не ответивших на лечение, исследователи проведут тесты таблицы непредвиденных обстоятельств хи-квадрат. Исследователи определяют как ответившего на лечение индивидуума, демонстрирующего улучшение, равное или превышающее 90% от базальной вирусной нагрузки. Все расчеты и тесты будут выполняться с использованием среды R для статистических вычислений версии 3.6.3. и его пакет статистики [R Core Team 2020].

Кроме того, для определения влияния ополаскивателей на жизнеспособность вирусов в слюне комитету по этике больницы было представлено дополнение, и после его одобрения для исследования были привлечены еще 62 пациента. В этом случае протокол включал ряд модификаций, а именно: (i) использование только базальных, 30-минутных и 60-минутных образцов (исключая 2-часовые образцы); (ii) не использовать инактивирующий вирус буфер для обеспечения жизнеспособности вируса; (iii) анализ инфекции in vitro для определения инфекционной способности вирусов слюны (инфекционная вирусная нагрузка), который был включен в качестве дополнительного результата. Подробности описаны ниже.

Исследование будет проводиться в регионах Мадрид, Валенсия и Мурсия в Испании, в четырех разных больницах: Университетской больнице Fundación Jiménez Díaz (Мадрид, Испания), Университетской больнице общего профиля Вильяльба (Мадрид, Испания), Университетской больнице Инфанты Елены (Мадрид, Испания). и Университетская больница Вирхен-де-ла-Аришака (Мурсия, Испания).

Всего у каждого пациента будет взято 3 нестимулированных образца слюны: один исходный и два после полоскания рта, через 30 и 60 минут соответственно. Пациентов попросят предоставить каждый нестимулированный образец слюны в стерильный пластиковый контейнер диаметром 10 см (не менее 2 мл образца) путем слюнотечения, избегая проливания выделений бронхиального происхождения. Три образца будут немедленно храниться при температуре -80ºC в герметичных пакетах, пока они не будут отправлены в лабораторию. Для анализа образцов все вторичные контейнеры герметичных пакетов с тремя образцами слюны каждого пациента будут помещены в жесткий бокс с сухим льдом в соответствии со стандартами UN3733 и отправлены в лабораторию (FISABIO) курьерской службой.

При получении образцов в Фонде ФИСАБИО они будут обрабатываться в помещениях лаборатории безопасности 3-го уровня следующим образом. После оттаивания образцов при комнатной температуре берут аликвоту 200 мкл для выделения РНК, а остальные аликвоты делят на аликвоты и сразу же хранят при -80°С для анализа в клеточных линиях.

Экстракция РНК будет проводиться с помощью полностью автоматизированной платформы eMAG (bioMérieux, Франция) в соответствии с инструкциями производителя образцов слюны. Одноэтапная rRT-PCR и амплификация SARSCoV-2 будут выполняться, как описано выше.

Для клеточной культуры клетки Vero-E6 (ATCC) культивируют в DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 1% заменимых аминокислот, 1 % L-глутамина и 25 мМ HEPES. Все клетки инкубируют при 37°C и 5% CO2.

Образцы слюны будут разбавлены 1:1 в 1X Дульбекко PBS. 300 мкл разбавленных образцов слюны инкубируют в течение одного часа при 37°C и 5% CO2 с 1,5×105 клеток Vero-E6 в 24-луночном планшете. Несвязанный вирус будет извлечен, а среда заменена 500 мкл инфекционной среды (DMEM с 2% FBS, 1% пенициллином/стрептомицином (P/S), 1% заменимыми аминокислотами, 1% L-глютамином, 25 мМ HEPES и Трипсин TPCK 6 мкг/мл). Инфицированные клетки Vero-E6 будут инкубироваться при 37°C и 5% CO2. Через 5 дней после заражения супернатант будет собран для выделения РНК в соответствии с инструкциями платформы eMAG и одноэтапной rRT-PCR для амплификации SARSCoV-2. Вирусная нагрузка, полученная после этого 5-дневного периода заражения, будет считаться инфекционной вирусной нагрузкой.