Antiseptiske mundskylninger for at reducere spyts viral belastning hos COVID-19-patienter (BUCOSARS)

Strategier, der reducerer spyts viral belastning, kan bidrage til at reducere risikoen for overførsel af SARS-CoV-2. Brugen af ​​mundskyl med antiseptiske midler, der har virucid aktivitet, kan således være en enkel og billig forebyggende strategi, som let kan anvendes i den generelle befolkning. For at evaluere effekten af ​​adskillige antiseptika til at neutralisere eller reducere SARS-CoV-2 viral belastning in vivo i spytprøver, er der designet et multicenter, randomiseret, blindt, fem-parallel gruppe, placebokontrolleret forsøg.

Undersøgelsen vil blive udført i Madrid, Valencia og Murcia-regionerne i Spanien på fem forskellige hospitaler: Fundación Jiménez Díaz Universitetshospital (Madrid, Spanien), Villalba Universitetshospital (Madrid, Spanien), Infanta Elena Universitetshospital (Madrid, Spanien) , Virgen de la Arixaca Universitetshospital (Murcia, Spanien) og Clínico de Valencia Universitetshospital (Valencia, Spanien).

Hver inkluderet patient er tidligere diagnosticeret og indlagt på grund af SARS-COV-2-infektion, idet de primært er indlagt for respiratorisk patologi. Alle vil være voksne (alder >18 år) og give deres frivillige skriftlige eller mundtlige samtykke til deltagelse i henhold til hospitalets etiske udvalgs anbefalinger.

Efter godkendelse af samtykke vil hospitalspersonalet, der er ansvarligt for interventionerne, fortløbende tildele hver deltager en kode efter ordren fra en tidligere tilfældigt genereret tabel. Koden vil bestå af et patientnummer og et bogstav svarende til en af ​​de fem undersøgelsesgrupper (A, B, C, D og E), som vil være kendt af det kliniske personale, men ukendt for laboratoriepersonalet, som skal behandle prøver og ekstrahere RNA, såvel som til dem, der vil analysere dataene. På denne måde vil deltagerne blive tilfældigt fordelt i en af ​​de fem behandlingsgrupper, og blinde vil blive opnået ved at bruge identiske rør med samme volumen til både mundskyllevand og placebo.

Hver inkluderet patient bliver bedt om ikke at spise, drikke andet end vand, tygge tyggegummi, ryge, børste tænder eller bruge mundskyl i en time før prøvetagning. Derudover må de ikke drikke i en halv time efter mundskylningen og spise hele testen.

Fem mundskyllevand er randomiseret: 2 % povidon-jod (gruppe A), 1 % hydrogenperoxid (gruppe B), 0,12 % klorhexidin (gruppe C), 0,07 % cetylpyridiniumchlorid (gruppe D) og destilleret vand (gruppe E), som kontrolgruppe. Gruppe C (Clorhexidina dental PHB©) og D (Vitis Xtra Forte©) skylninger er klar til brug i deres kommercielle formler. I tilfælde af mundskyllevand A og B skal koncentrationerne justeres til dem, der tidligere er angivet ved at fortynde kommercielle formler med destilleret vand minutter før skylning (3 mL povidon-jod 10 % til oral brug med 12 mL destilleret vand, i gruppe A og 5 ml hydrogenperoxid 3%- Oximen© med 10 ml destilleret vand i gruppe B). Alle mundskyllevand og deres respektive fortyndinger er kommercielle produkter klassificeret som sikre.

I alt 4 ikke-stimulerede spytprøver vil blive indsamlet for hver patient: en basal og tre efter mundskylningen, henholdsvis efter 30 minutter, efter 60 minutter og efter 120 minutter. Patienterne vil blive bedt om at give hver ustimuleret spytprøve i en steril plastikbeholder med en diameter på 10 cm (mindst 0,5 ml prøve) ved at savle og undgå spild af sekret af bronkial oprindelse. Umiddelbart efter hver prøveudtagning overføres 0,5 mL spyt til et sterilt Eppendorf-rør med 1,5 mL virusinaktiverende buffer mærket med patientkoden og prøvetiden og opbevaret ved 4 °C. De fire Eppendorf-rør pr. patient vil blive indført i en lufttæt pose, der indeholder beskyttende absorberende materiale i tilfælde af uønsket åbning eller brud. De sekundære beholdere vil blive indført i en stiv kasse i henhold til UN3733-standarder og sendt til laboratoriet med kurerservice til analyse.

En alikvot på 1 ml af hver spytprøve fortyndet i den virusinaktiverende buffer i forholdet 1:3 vil blive brugt til RNA-ekstraktion ved hjælp af en standard TRIzol-baseret metode. Kort fortalt tilsættes 3 ml TRIzol og 600 µl chloroform, vortexes kraftigt i 15 sekunder og inkuberes på is i 10 minutter. Derefter centrifugeres prøverne ved 12.000 g i 15 minutter ved 4 °C, og den vandige fase overføres til to rene mikrorør med 750 ul isopropanol. Rørene blandes ved inversion og inkuberes i 15 minutter før centrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pellets vaskes med 1 ml 80 % kold ethanol, vortexes for at blandes grundigt og centrifugeres ved 7.500 g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanter vil omhyggeligt aspireres og kasseres, og pellets tørres ved stuetemperatur i 10 minutter, før de resuspenderes i 15 ul RNAse-frit vand og samles i et enkelt rør.

Et-trins rRT-PCR vil blive udført ved hjælp af SuperScript™ III One-Step RT-PCR-system med Platinum™ Taq DNA-polymerase (Invitrogen-12574026) i henhold til producentens instruktioner. Til amplifikation af SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay) genet vil PCR blive udført efter Charité-Berlin protokollen i en LightCycler 480 2.0 (Roche) platform. I samme kørsel vil prøver blive amplificeret med husholdnings-human-gen RNP (Ribonuclease P)-primere for at vurdere prøvekvaliteten. Alle prøver vil blive kørt i to replikater sammen med en tidligere kendt positiv og negativ kontrol. Viruskopier vil blive kvantificeret ved hjælp af en 10-folds fortyndingsstandardkurve af RNA-transkripter, der tidligere er genereret (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Viruskopier blev normaliseret med ml spyt.

Med hensyn til de analyser, der skal udføres, er hovedformålet med undersøgelsen at bestemme effekten af ​​de forskellige mundskyllevand på SARS-Cov2 viral belastning i spyt testet in vivo. Det primære resultat vil således være ændringen i spyts viral belastning mellem baseline og de tre tidspunkter efter mundskylning i hver behandling. Derudover vil korrelationerne mellem den basale virale belastning før skylning med de forskellige indsamlede kliniske data, såsom alder, køn, dage siden forekomsten af ​​symptomer og dage siden patienternes viruspositivitet bestemt ved PCR af nasopharyngeale prøver også blive undersøgt . Til sidst vil de mulige sammenhænge mellem kategoriske kliniske variabler og hyppigheden af ​​patienter, som forbedrer sig i viral belastning på forskellige tidspunkter for de forskellige behandlinger, blive evalueret.

I betragtning af, at hver frivillig fungerer som deres egen kontrol, blev en prøvestørrelse på 15 patienter pr. gren anset for tilstrækkelig til at identificere signifikante forskelle i viral mængde, når man sammenligner viral load-værdierne i spyt til enhver tid med hensyn til niveauerne før skylning med mundskylningen. på mere end 20 % mellem tidspunkterne, idet man antager et tab på 10 % af patienter på grund af opgivelse eller lav viral belastning og anvender en alfa på 0,05 og en styrke på 0,8. Da der var programmeret 5 grene i forsøget (povidon-jod, hydrogenperoxid, chlorhexidin, cetylpyridiniumchlorid og kontrollen), var 75 patienter det mindste antal personer, der skulle rekrutteres, og som vil blive fordelt på de forskellige hospitaler.

En Wilcoxon signed-rank test vil blive brugt til at teste gennemsnitlige forskelle, både for det parrede tilfælde (når man sammenligner observationer på forskellige tidspunkter for de samme individer), og for det uparrede tilfælde (når man sammenligner forskellige behandlinger baseret på relative ændringer af viral belastning). Derudover vil nogle tests for sammenhæng mellem parrede prøver ved hjælp af Spearmans korrelationskoefficienter blive udført for at vurdere forholdet mellem viral belastning og andre kliniske kontinuerlige variabler. Til sidst, for at evaluere sammenhænge mellem kliniske kategoriske variabler og hyppigheden af ​​respondere/ikke-respondere på behandlingerne, vil efterforskerne udføre chi-kvadrat-kontingenstabeltest. Efterforskerne definerer som responder et individ, der udviser en forbedring svarende til eller større end 90 % af den basale virusmængde. Alle beregninger og test vil blive udført ved hjælp af R-miljøet til statistisk databehandling version 3.6.3 og dens 'stats'-pakke [R Core Team 2020].

For at bestemme effekten af ​​mundskyllevandene på viraernes levedygtighed i spyt blev der desuden forelagt et tillæg til hospitalets etiske udvalg, og efter dets godkendelse blev yderligere 62 patienter rekrutteret til undersøgelsen. I dette tilfælde indeholdt protokollen en række modifikationer, nemlig: (i) brugen af ​​kun basale, 30 minutters og 60 minutters prøver (ekskluderet 2 timers prøver); (ii) ikke at bruge virusinaktiverende buffer for at sikre viral levedygtighed; (iii) et in vitro-infektionsassay for at bestemme den infektionsmæssige kapacitet af spytvira (infektiøs viral belastning), som er inkluderet som et yderligere resultat. Detaljerne er beskrevet nedenfor.

Undersøgelsen vil blive udført i Madrid, Valencia og Murcia-regionerne i Spanien på fire forskellige hospitaler: Fundación Jiménez Díaz Universitetshospital (Madrid, Spanien), Villalba Universitetshospital (Madrid, Spanien), Infanta Elena Universitetshospital (Madrid, Spanien) og Virgen de la Arixaca Universitetshospital (Murcia, Spanien).

I alt 3 ikke-stimulerede spytprøver vil blive indsamlet for hver patient: en basal og to efter mundskylningen, henholdsvis efter 30 minutter og efter 60 minutter. Patienterne vil blive bedt om at give hver ustimuleret spytprøve i en steril plastikbeholder med en diameter på 10 cm (mindst 2 ml prøve) ved at savle og undgå spild af sekret af bronkial oprindelse. De tre prøver vil straks blive opbevaret ved -80ºC i lufttætte poser, indtil de sendes til laboratoriet. Til prøveanalyse vil alle sekundære beholdere med lufttætte poser med de tre spytprøver fra hver patient blive indført i en stiv boks med tøris i henhold til UN3733 standarder og sendt til laboratoriet (FISABIO) med kurerservice.

Når prøverne modtages hos FISABIO Foundation, vil de blive behandlet i faciliteterne i niveau 3 sikkerhedslaboratoriet som følger. Efter optøning af prøverne ved stuetemperatur udtages en 200 µl aliquot til RNA-ekstraktion, og resten vil blive aliquoteret og straks opbevaret ved -80C til analyse i cellelinjer.

RNA-ekstraktion vil blive udført med den fuldt automatiserede platform eMAG (bioMérieux, Frankrig) efter producentens instruktioner for spytprøver. Et-trins rRT-PCR og amplifikation af SARSCoV-2 vil blive udført som beskrevet ovenfor.

Til cellekulturen dyrkes Vero-E6-celler (ATCC) i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1 % L-glutamin og 25 mM HEPES. Alle celler inkuberes ved 37°C og 5% CO2.

Spytprøver vil blive fortyndet 1:1 i 1X Dulbeccos PBS. 300 ul fortyndede spytprøver vil blive inkuberet i en time ved 37°C og 5% CO2 med 1,5x105 Vero-E6-celler i en 24-brønds plade. Ubundet virus vil blive ekstraheret, og mediet erstattes af 500 ul infektionsmedie (DMEM med 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1 % ikke-essentielle aminosyrer, 1 % L-glutamin, 25 mM HEPES og Tripsin TPCK 6 ug/ml). Inficerede Vero-E6-celler vil blive inkuberet ved 37°C og 5% CO2. Efter 5 dages infektion vil supernatanten blive opsamlet til RNA-ekstraktion ved at følge eMAG-platformens instruktioner og et-trins rRT-PCR udført til amplifikation af SARSCoV-2. Den virale mængde opnået efter denne 5-dages infektionsperiode vil blive betragtet som den infektive virusmængde.