Sciacqui antisettici della bocca per ridurre il carico virale salivare nei pazienti COVID-19 (BUCOSARS)

Strategie di riduzione della carica virale salivare potrebbero contribuire a ridurre il rischio di trasmissione di SARS-CoV-2. Pertanto, l'uso di collutori con antisettici che hanno attività virucida può essere una strategia preventiva semplice ea basso costo che potrebbe essere facilmente applicata nella popolazione generale. Per valutare l'effetto di diversi antisettici per neutralizzare o ridurre la carica virale SARS-CoV-2 in vivo nei campioni di saliva, è stato progettato uno studio multicentrico, randomizzato, cieco, a cinque gruppi paralleli, controllato con placebo.

Lo studio sarà condotto nelle regioni di Madrid, Valencia e Murcia in Spagna, in cinque diversi ospedali: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spagna), Villalba University General Hospital (Madrid, Spagna), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spagna) , Ospedale Universitario Virgen de la Arixaca (Murcia, Spagna) e Ospedale Universitario Clínico de Valencia (Valencia, Spagna).

Ogni paziente incluso viene preventivamente diagnosticato e ricoverato per infezione da SARS-COV-2, essendo ricoverato principalmente per patologia respiratoria. Tutti loro saranno adulti (età >18 anni) e forniranno il loro consenso volontario scritto o orale alla partecipazione secondo le raccomandazioni del comitato etico dell'ospedale.

Dopo l'approvazione del consenso, il personale ospedaliero responsabile degli interventi assegnerà consecutivamente a ciascun partecipante un codice seguendo l'ordine da una tabella precedentemente generata in modo casuale. Il codice sarà composto da un numero di paziente e da una lettera corrispondente a uno dei cinque gruppi di studio (A, B, C, D ed E), noto al personale clinico ma sconosciuto al personale di laboratorio che processerà i campioni e estrarre l'RNA, così come a coloro che analizzeranno i dati. In questo modo, i partecipanti verranno assegnati in modo casuale a uno dei cinque gruppi di trattamento e il cieco verrà raggiunto utilizzando provette identiche con lo stesso volume sia per i collutori che per il placebo.

A ogni paziente incluso viene chiesto di non mangiare, bere altro che acqua, masticare gomme, fumare, lavarsi i denti o usare collutori per un'ora prima della raccolta del campione. Inoltre, non possono bere per mezz'ora dopo il collutorio e mangiare per l'intero test.

Cinque collutori sono stati randomizzati: 2% di povidone-iodio (gruppo A), 1% di perossido di idrogeno (gruppo B), 0,12% di clorexidina (gruppo C), 0,07% di cetilpiridinio cloruro (gruppo D) e acqua distillata (gruppo E), come gruppo di controllo. I risciacqui del gruppo C (Clorhexidina dental PHB©) e D (Vitis Xtra Forte©) sono pronti all'uso nelle loro formule commerciali. Nel caso dei collutori A e B, le concentrazioni vanno adeguate a quelle precedentemente indicate diluendo le formule commerciali con acqua distillata minuti prima del risciacquo (3 mL di iodopovidone 10% per uso orale con 12 mL di acqua distillata, in gruppo A e 5 mL di perossido di idrogeno 3%- Oximen© con 10 mL di acqua distillata, nel gruppo B). Tutti i collutori e le rispettive diluizioni sono prodotti commerciali classificati come sicuri.

Verranno raccolti un totale di 4 campioni di saliva non stimolata per ogni paziente: uno basale e tre dopo il collutorio, rispettivamente a 30 minuti, a 60 minuti ea 120 minuti. Ai pazienti verrà chiesto di fornire ogni campione di saliva non stimolato in un contenitore di plastica sterile di 10 cm di diametro (almeno 0,5 mL di campione) sbavando, evitando di versare secrezioni di origine bronchiale. Immediatamente dopo ogni campionamento, 0.5 mL di saliva saranno trasferiti in una provetta Eppendorf sterile con 1.5 mL di tampone di inattivazione del virus etichettato con il codice del paziente e l'ora del campione e conservato a 4 °C. Le quattro provette Eppendorf per paziente verranno introdotte in un sacchetto ermetico, contenente materiale assorbente protettivo in caso di apertura o rottura indesiderate. I contenitori secondari verranno introdotti in una scatola rigida secondo gli standard UN3733 e inviati al laboratorio tramite corriere per l'analisi.

Un'aliquota di 1 ml di ciascun campione di saliva diluito nel tampone di inattivazione del virus in proporzione 1:3, verrà utilizzato per l'estrazione dell'RNA utilizzando un metodo standard basato su TRIzol. In breve, verranno aggiunti 3 ml di TRIzol e 600 ul di cloroformio, vortexati vigorosamente per 15 secondi e incubati in ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, i campioni saranno centrifugati a 12.000 g per 15 min a 4 °C e la fase acquosa trasferita in due microprovette pulite con 750 ul di isopropanolo. Le provette saranno mescolate per inversione e incubate per 15 minuti prima della centrifugazione a 12.000 g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante verrà scartato per decantazione e i pellet lavati con 1 ml di etanolo freddo all'80%, vortexati per miscelare accuratamente e centrifugati a 7.500 g per 5 minuti a 4 °C. I surnatanti saranno accuratamente aspirati e scartati, ei pellet essiccati a temperatura ambiente per 10 minuti prima di essere risospesi in 15 ul di acqua priva di RNAse e riuniti in una singola provetta.

La rRT-PCR a una fase verrà eseguita utilizzando il sistema RT-PCR a una fase SuperScript™ III con Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen-12574026) secondo le istruzioni del produttore. Per l'amplificazione del gene SARSCoV-2 E (betacoronavirus screening assay), la PCR sarà eseguita seguendo il protocollo Charité-Berlin in una piattaforma LightCycler 480 2.0 (Roche). Nella stessa corsa, i campioni saranno amplificati con primer RNP (ribonucleasi P) del gene umano housekeeping per valutare la qualità del campione. Tutti i campioni verranno analizzati in due replicati, insieme a controlli positivi e negativi precedentemente noti. Le copie del virus saranno quantificate utilizzando una curva standard di diluizione 10 volte di trascritti di RNA precedentemente generati (EDX SARS-CoV-2 Standard, EXACT DIAGNOSTICS EDX). Le copie del virus sono state normalizzate da ml di saliva.

Per quanto riguarda le analisi da eseguire, l'obiettivo principale dello studio è determinare l'effetto dei diversi collutori sulla carica virale SARS-Cov2 nella saliva testata in vivo. Pertanto, l'esito primario sarà la variazione della carica virale salivare tra il basale e i tre punti temporali post-collutorio in ciascun trattamento. Verranno inoltre studiate le correlazioni tra la carica virale basale prima del risciacquo con i diversi dati clinici raccolti, quali età, sesso, giorni dalla comparsa dei sintomi e giorni dalla positività al virus dei pazienti determinata mediante PCR su campioni nasofaringei . Infine, verranno valutate le possibili associazioni tra variabili cliniche categoriche e la frequenza dei pazienti che migliorano la carica virale in tempi diversi per i diversi trattamenti.

Considerando che ogni volontario funge da controllo di se stesso, confrontando i valori di carica virale nella saliva in ogni momento rispetto ai livelli prima del risciacquo con il collutorio, un campione di 15 pazienti per ramo è stato considerato sufficiente per identificare differenze significative di carica virale di oltre il 20% tra i punti temporali, ipotizzando una perdita del 10% di pazienti a causa di abbandono o bassa carica virale e adottando un alfa di 0,05 e una potenza di 0,8. Poiché nella sperimentazione sono state programmate 5 branche (iodio-povidone, perossido di idrogeno, clorexidina, cloruro di cetilpiridinio e controllo), 75 pazienti erano il numero minimo di individui totali da reclutare, che saranno distribuiti tra i diversi ospedali.

Verrà utilizzato un test dei ranghi con segno di Wilcoxon per testare le differenze medie, sia per il caso accoppiato (quando si confrontano le osservazioni in punti temporali diversi per gli stessi individui), sia per il caso non accoppiato (quando si confrontano diversi trattamenti basati sui cambiamenti relativi di carica virale). Inoltre, verranno eseguiti alcuni test di associazione tra campioni accoppiati utilizzando i coefficienti di correlazione di Spearman per valutare la relazione tra carica virale e altre variabili cliniche continue. Infine, al fine di valutare le associazioni tra le variabili categoriche cliniche e la frequenza dei responder/non responder ai trattamenti, i ricercatori eseguiranno test della tabella di contingenza del chi quadrato. Gli investigatori definiscono come responder un individuo che mostra un miglioramento pari o superiore al 90% della carica virale basale. Tutti i calcoli e i test verranno eseguiti utilizzando l'ambiente R per il calcolo statistico versione 3.6.3 e il suo pacchetto "stats" [R Core Team 2020].

Inoltre, per determinare l'effetto dei collutori sulla vitalità dei virus nella saliva, è stato presentato un addendum al comitato etico dell'ospedale e, dopo la sua approvazione, sono stati reclutati altri 62 pazienti per lo studio. In questo caso il protocollo prevedeva una serie di modifiche, ovvero: (i) l'utilizzo di campioni basali, a 30 minuti ea 60 minuti (esclusi i campioni a 2 ore); (ii) non utilizzare il tampone di inattivazione del virus per garantire la vitalità virale; (iii) un test di infezione in vitro per determinare la capacità infettiva dei virus salivari (carica virale infettiva), che è stato incluso come risultato aggiuntivo. I dettagli sono descritti di seguito.

Lo studio sarà condotto nelle regioni di Madrid, Valencia e Murcia in Spagna, in quattro diversi ospedali: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spagna), Villalba University General Hospital (Madrid, Spagna), Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spagna) e Ospedale Universitario Virgen de la Arixaca (Murcia, Spagna).

Verranno raccolti un totale di 3 campioni di saliva non stimolata per ogni paziente: uno basale e due dopo il collutorio, rispettivamente a 30 minuti ea 60 minuti. Ai pazienti verrà chiesto di fornire ogni campione di saliva non stimolato in un contenitore di plastica sterile di 10 cm di diametro (almeno 2 mL di campione) sbavando, evitando di versare secrezioni di origine bronchiale. I tre campioni verranno immediatamente conservati a -80ºC in sacchetti ermetici fino all'invio al laboratorio. Per l'analisi del campione, tutti i contenitori secondari di buste ermetiche con i tre campioni di saliva di ciascun paziente verranno introdotti in una scatola rigida con ghiaccio secco secondo le norme UN3733 e inviati al laboratorio (FISABIO) tramite corriere.

Al ricevimento dei campioni presso la Fondazione FISABIO, questi verranno processati nelle strutture del laboratorio di sicurezza di livello 3 come segue. Dopo aver scongelato i campioni a temperatura ambiente, un'aliquota di 200 uL sarà prelevata per l'estrazione dell'RNA, e il resto sarà aliquotato e immediatamente conservato a -80°C per il dosaggio in linee cellulari.

L'estrazione dell'RNA sarà effettuata con la piattaforma completamente automatizzata eMAG (bioMérieux, Francia) seguendo le istruzioni del produttore per i campioni di saliva. Una fase rRT-PCR e l'amplificazione del SARSCoV-2 saranno eseguite come descritto sopra.

Per la coltura cellulare, le cellule Vero-E6 (ATCC) sono coltivate in DMEM integrato con 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 1% di penicillina/streptomicina (P/S), 1% di amminoacidi non essenziali, 1 % L-glutammina e HEPES 25mM. Tutte le cellule vengono incubate a 37°C e 5% CO2.

I campioni di saliva saranno diluiti 1:1 in 1X Dulbecco's PBS. 300 ul di campioni di saliva diluiti saranno incubati per un'ora a 37°C e 5% CO2 con 1.5x105 cellule Vero-E6 in una piastra da 24 pozzetti. Il virus non legato verrà estratto e il terreno sostituito da 500 ul di terreno di infezione (DMEM con 2% FBS, 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1% aminoacidi non essenziali, 1% L-glutammina, 25mM HEPES e Tripsina TPCK 6 ug/ml). Le cellule Vero-E6 infette saranno incubate a 37°C e 5% CO2. Dopo 5 giorni di infezione, il surnatante sarà raccolto per l'estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni della piattaforma eMAG e verrà eseguita una fase rRT-PCR per l'amplificazione del SARSCoV-2. La carica virale ottenuta dopo questo periodo di infezione di 5 giorni sarà considerata la carica virale infettiva.