COVID-19 환자의 타액 바이러스 부하를 줄이기 위한 살균 구강 세정제 (BUCOSARS)

타액의 바이러스 부하를 줄이는 전략은 SARS-CoV-2의 전파 위험을 줄이는 데 기여할 수 있습니다. 따라서 살바이러스 활성이 있는 방부제가 포함된 구강청결제를 사용하는 것은 일반 대중에게 쉽게 적용할 수 있는 간단하고 저렴한 예방 전략이 될 수 있습니다. 타액 샘플에서 생체 내 SARS-CoV-2 바이러스 부하를 중화하거나 감소시키는 여러 방부제의 효과를 평가하기 위해 다중 센터, 무작위, 맹검, 5병렬 그룹, 위약 대조 시험이 설계되었습니다.

이 연구는 스페인의 마드리드, 발렌시아 및 무르시아 지역의 5개 병원에서 수행됩니다: Fundación Jiménez Díaz 대학 병원(스페인 마드리드), Villalba 대학 종합 병원(스페인 마드리드), Infanta Elena 대학 병원(스페인 마드리드) , Virgen de la Arixaca 대학 병원(스페인 무르시아) 및 Clínico de Valencia 대학 병원(스페인 발렌시아).

포함된 모든 환자는 SARS-COV-2 감염으로 인해 이전에 진단을 받고 입원했으며 주로 호흡기 병리로 인해 입원했습니다. 그들 모두는 성인(연령 >18세)이며 병원 윤리 위원회 권장 사항에 따라 참여에 대한 자발적인 서면 또는 구두 동의를 제공합니다.

동의 승인 후 중재를 담당하는 병원 직원은 이전에 무작위로 생성된 테이블의 순서에 따라 각 참가자에게 코드를 연속적으로 할당합니다. 코드는 5개의 연구 그룹(A, B, C, D 및 E) 중 하나에 해당하는 환자 번호와 문자로 구성되며 임상 직원에게는 알려지지만 샘플을 처리하고 데이터를 분석할 RNA뿐만 아니라 RNA를 추출합니다. 이러한 방식으로 참가자는 5개의 치료 그룹 중 하나에 무작위로 배정되고 맹인은 구강 세척제와 위약 모두에 대해 동일한 용량의 동일한 튜브를 사용하여 달성됩니다.

포함된 모든 환자는 샘플 수집 전 1시간 동안 먹거나 물, 껌 씹기, 흡연, 양치질 또는 구강 세척제를 사용하는 것 외에는 아무것도 마시지 말 것을 요청받습니다. 또한 구강 세척 후 30분 동안은 물을 마시지 말고 전체 검사 동안 식사를 하십시오.

5가지 구강청결제가 무작위 배정됩니다: 2% 포비돈 요오드(그룹 A), 1% 과산화수소(그룹 B), 0.12% 클로르헥시딘(그룹 C), 0.07% 세틸피리디늄 클로라이드(그룹 D) 및 증류수(그룹 E). 대조군. 그룹 C(Clorhexidina dental PHB©) 및 D(Vitis Xtra Forte©) 린스는 상용 제품에 바로 사용할 수 있습니다. 구강청결제 A와 B의 경우, 헹구기 몇 분 전에 상업용 포뮬러를 증류수로 희석하여 이전에 표시된 농도로 조정해야 합니다(경구용 포비돈 요오드 10% 3mL와 증류수 12mL, 그룹 A 및 5mL의 과산화수소 3%-Oximen®과 10mL의 증류수, 그룹 B). 모든 구강 세척제와 각각의 희석액은 안전한 것으로 분류된 상업용 제품입니다.

각 환자에 대해 총 4개의 비자극 타액 샘플을 수집합니다: 구강 세척 후 각각 30분, 60분 및 120분에 기본 1개 및 3개. 환자는 자극받지 않은 각 타액 샘플을 멸균된 직경 10cm의 플라스틱 용기(최소 0.5mL의 샘플)에 기관지 분비물이 쏟아지지 않도록 침을 흘리며 제공하도록 요청받을 것입니다. 각 샘플링 직후, 0.5mL의 타액을 환자 코드와 샘플 시간이 표시된 1.5mL의 바이러스 비활성화 버퍼가 있는 멸균 Eppendorf 튜브로 옮기고 4°C에서 보관합니다. 환자당 4개의 Eppendorf 튜브는 원치 않는 개봉 또는 파손의 경우 보호 흡수재가 들어 있는 밀폐 백에 담겨 제공됩니다. 2차 용기는 UN3733 표준에 따라 단단한 상자에 넣어 분석을 위해 택배로 실험실로 보냅니다.

바이러스 불활성화 완충액에 1:3 비율로 희석된 각 타액 샘플 1ml의 분취량은 표준 TRIzol 기반 방법을 사용하여 RNA 추출에 사용됩니다. 간략하게, 3ml의 TRIzol과 600ul의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 격렬하게 vortex한 다음 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4°C에서 15분 동안 12,000g에서 원심분리하고 수성상을 750ul의 이소프로판올과 함께 2개의 깨끗한 마이크로튜브로 옮깁니다. 튜브는 반전에 의해 혼합되고 4°C에서 10분 동안 12,000g에서 원심분리하기 전에 15분 동안 배양됩니다. 상층액은 따라내고 펠릿은 1ml의 80% 차가운 에탄올로 세척하고 와동하여 완전히 혼합한 다음 4°C에서 5분 동안 7,500g에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 폐기하고 펠릿을 실온에서 10분 동안 건조시킨 후 15ul의 RNAse가 없는 물에 재현탁하고 단일 튜브에 모았습니다.

제조업체의 지침에 따라 Platinum™ Taq DNA Polymerase(Invitrogen-12574026)가 포함된 SuperScript™ III One-Step RT-PCR 시스템을 사용하여 원스텝 rRT-PCR을 수행합니다. SARSCoV-2 E(betacoronavirus screening assay) 유전자 증폭을 위해 LightCycler 480 2.0(Roche) 플랫폼에서 Charité-Berlin 프로토콜에 따라 PCR을 수행합니다. 동일한 실행에서 표본 품질을 평가하기 위해 하우스키핑 인간 유전자 RNP(Ribonuclease P) 프라이머로 표본을 증폭합니다. 모든 샘플은 이전에 알려진 양성 및 음성 대조군과 함께 두 번의 복제로 실행됩니다. 바이러스 사본은 이전에 생성된 RNA 전사체의 10배 희석 표준 곡선을 사용하여 정량화됩니다(EDX SARS-CoV-2 표준, EXACT DIAGNOSTICS EDX). 바이러스 사본은 타액 ml로 표준화되었습니다.

수행할 분석과 관련하여 연구의 주요 목적은 생체 내에서 테스트한 타액의 SARS-Cov2 바이러스 부하에 대한 다양한 구강 세척제의 효과를 결정하는 것입니다. 따라서, 1차 결과는 각 치료에서 기준선과 3개의 구강 세척 후 시점 사이의 타액 바이러스 부하의 변화일 것입니다. 또한, 연령, 성별, 증상 발현 이후 일수 및 비인두 샘플의 PCR에 의해 결정된 환자의 바이러스 양성 이후 일수와 같이 수집된 다양한 임상 데이터와 헹굼 전 기저 바이러스 양 사이의 상관관계도 연구될 것입니다. . 마지막으로 범주형 임상 변수와 다른 치료에 대해 다른 시간에 바이러스 부하가 개선되는 환자의 빈도 사이의 가능한 연관성을 평가할 것입니다.

각 지원자가 자신의 통제 역할을 한다는 점을 고려할 때, 구강청결제로 헹구기 전 수준과 관련하여 매번 타액의 바이러스 부하 값을 비교할 때 분기당 15명의 환자 샘플 크기는 상당한 바이러스 부하 차이를 식별하기에 충분한 것으로 간주되었습니다. 포기 또는 낮은 바이러스 부하로 인한 환자 손실이 10%라고 가정하고 알파 0.05와 검정력 0.8을 채택하여 시점 사이에 20% 이상입니다. 시험에서 5가지 가지(포비돈-요오드, 과산화수소, 클로르헥시딘, 세틸피리디늄 클로라이드 및 대조군)가 프로그래밍되었기 때문에, 75명의 환자가 모집될 최소 총 개인 수였으며, 이들은 서로 다른 병원에 분배될 것입니다.

Wilcoxon 부호 순위 테스트는 쌍을 이룬 경우(동일한 개인에 대해 서로 다른 시점에서 관측값을 비교할 때)와 짝을 이루지 않은 경우(각 개체의 상대적인 변화를 기반으로 다른 치료를 비교할 때)의 평균 차이를 테스트하는 데 사용됩니다. 바이러스 부하). 또한 Spearman의 상관 계수를 사용하여 쌍을 이룬 샘플 간의 연관성에 대한 일부 테스트를 수행하여 바이러스 부하와 기타 임상 연속 변수 간의 관계를 평가합니다. 마지막으로, 임상 범주 변수와 치료에 대한 반응자/비반응자의 빈도 사이의 연관성을 평가하기 위해 연구자는 카이 제곱 분할표 테스트를 수행합니다. 연구자들은 기저 바이러스 부하의 90% 이상 개선을 나타내는 개인을 반응자로 정의합니다. 모든 계산 및 테스트는 통계 컴퓨팅 버전 3.6.3용 R 환경을 사용하여 수행됩니다. 및 '통계' 패키지 [R Core Team 2020].

또한 구강청결제가 타액 내 바이러스의 생존력에 미치는 영향을 확인하기 위해 병원 윤리위원회에 부록을 제출했고 승인 후 62명의 환자를 추가로 모집했다. 이 경우 프로토콜에는 다음과 같은 많은 수정 사항이 포함되었습니다. 즉, (i) 기본, 30분 및 60분 샘플만 사용(2시간 샘플 제외) (ii) 바이러스 생존력을 보장하기 위해 바이러스 불활성화 완충액을 사용하지 않음; (iii) 추가 결과로 포함된 타액 바이러스의 감염 능력(감염 바이러스 부하)을 결정하기 위한 체외 감염 분석. 자세한 내용은 아래에 설명되어 있습니다.

이 연구는 스페인의 마드리드, 발렌시아 및 무르시아 지역에서 4개의 다른 병원에서 수행됩니다: Fundación Jiménez Díaz 대학 병원(스페인 마드리드), Villalba 대학 종합 병원(스페인 마드리드), Infanta Elena 대학 병원(스페인 마드리드) 및 Virgen de la Arixaca 대학 병원(스페인 무르시아).

각 환자에 대해 총 3개의 비자극 타액 샘플을 수집합니다: 구강 세척 후 각각 30분 및 60분에 기초 1개 및 2개. 환자는 자극받지 않은 각 타액 샘플을 직경 10cm의 멸균 플라스틱 용기(최소 2mL의 샘플)에 기관지 분비물이 쏟아지지 않도록 침을 흘리며 제공하도록 요청받습니다. 세 개의 샘플은 실험실로 보내질 때까지 밀폐된 백에 -80ºC에서 즉시 보관됩니다. 샘플 분석을 위해 각 환자의 3개의 타액 샘플이 담긴 밀폐 백의 모든 2차 용기는 UN3733 표준에 따라 드라이아이스와 함께 단단한 상자에 담겨 택배로 실험실(FISABIO)로 보내집니다.

FISABIO 재단에서 샘플을 수령하면 다음과 같이 3등급 보안 실험실의 시설에서 처리됩니다. 샘플을 실온에서 해동한 후, RNA 추출을 위해 200uL 분취량을 취하고, 나머지는 분취하고 즉시 세포주 분석을 위해 -80C에 보관합니다.

RNA 추출은 타액 샘플에 대한 제조업체의 지침에 따라 전자동 플랫폼 eMAG(프랑스 바이오메리외)로 수행됩니다. 한 단계 rRT-PCR 및 SARSCoV-2의 증폭은 위에서 설명한 대로 수행됩니다.

세포 배양을 위해 Vero-E6 세포(ATCC)는 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 1% 비필수 아미노산, 1이 보충된 DMEM에서 배양됩니다. % L-글루타민 및 25mM HEPES. 모든 세포는 37°C 및 5% CO2에서 배양됩니다.

타액 샘플은 1X Dulbecco PBS에서 1:1로 희석됩니다. 희석된 타액 샘플 300ul를 24웰 플레이트에서 1.5x105 Vero-E6 세포와 함께 37°C 및 5% CO2에서 1시간 동안 배양합니다. 결합되지 않은 바이러스를 추출하고 배지를 500ul의 감염 배지(2% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 1% 비필수 아미노산, 1% L-글루타민, 25mM HEPES 및 트립신 TPCK 6ug/ml). 감염된 Vero-E6 세포는 37°C 및 5% CO2에서 배양됩니다. 감염 5일 후, eMAG 플랫폼 지침 및 SARSCoV-2 증폭을 위해 수행된 1단계 rRT-PCR에 따라 RNA 추출을 위해 상청액을 수집합니다. 이 5일의 감염 기간 후에 얻은 바이러스 양은 감염성 바이러스 양으로 간주됩니다.