ERASE - マラリア対策に対する新型コロナウイルス感染症の影響 (ERASE)

1. はじめに

1.1. マラリア疫学と世界的傾向 世界では、2020年のマラリア常在国85カ国で推定2億4,100万人のマラリア症例が発生し、2019年の2億2,700万人から増加しましたが、この増加の大部分はWHOアフリカ地域の国々によるものです。

マラリアは依然として公衆衛生にとって大きな脅威となっていますが、過去 20 年間でマラリア対策は大きく前進し、推定 15 億人の感染を回避し、760 万人の命を救いました。 マラリアによる死亡率は、2000年から2019年にかけて60％減少し、特にアフリカでは2000年のアブジャ宣言によって火がついた政治的関与が成功の鍵となった。 これらのデータは、強力な政治的リーダーシップとともに、公衆衛生プログラムによってもたらされるマラリアの制御と予防における潜在的な利点を概説しています。 しかし、過去 20 年間に達成された驚くべき成果にも関わらず、2020 年には、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックにより、この病気との闘いに重大な課題が加わり、低中所得国（LMIC）に大きなリスクをもたらしました。 実際、サハラ以南の国々では、すでに脆弱な医療制度に直接突きつけられている重大な危険に加え、サプライチェーンの中断や個人の意思決定の適応によってマラリア対策が脅かされています。 実際、マラリア対策は治療を受ける個人の選択に大きく依存しており、SARS-CoV2感染の削減を目的とした初期のメッセージでは、発熱の場合は自宅にいるよう人々に勧告されていた。 地球統計モデルによると、これらの要因は、最悪のシナリオでは、今後数年間でマラリア感染者数が 21% 増加し、マラリア関連死亡者数がほぼ 2 倍に増加すると推定される可能性があります。 さらに、サハラ以南諸国における新型コロナウイルス感染症の本当の負担は不明であり、血清有病率調査によれば、大幅に過小評価されている可能性が高い。 最新のWHO世界マラリア報告書によると、これらすべての要因が、マラリアの発生率（2019年は56人だったのに対し、2020年はリスクのある人1000人当たり59人）とマラリアによる死亡者数が53万4,000人から減少傾向に逆転することに貢献したという。 2019 年には 602,000 人、2020 年には 602,000 人に増加します。

マラリア撲滅に向けた他の大きな課題としては、薬剤耐性、診断を損なう変異の獲得、特に迅速診断検査の感度に影響を与える変異の獲得、治療へのアクセス、殺虫剤処理蚊帳（ITN）、屋内残留物などのマラリア予防ツールの供給が挙げられます。スプレー（IRS）、季節性マラリア化学予防（SMC）、および妊婦の間欠的予防治療（IPTp）。

1.3 研究上の質問

1. 新型コロナウイルス感染症のパンデミックは、オヤム地区とコール地区の妊婦のマラリアケアとマラリア関連予防の姿勢にどのような影響を与えましたか?
2. オヤム地区とコール地区における SP およびアルテミシニンに対する臨床耐性の蔓延はどの程度ですか?
3. 新型コロナウイルス感染症のパンデミックと抗マラリア耐性は、妊婦のマラリア関連転帰にどのような影響を与えたのでしょうか?

1.4 目的 1.4.1 主な目的 この研究の一般的な目的は、ウガンダ北部の妊婦におけるマラリア予防、診断、治療に対する抗マラリア薬耐性と新型コロナウイルス感染症のパンデミックの影響を評価することです。

1.4.2 具体的な目的

1. 新型コロナウイルス感染症のパンデミックが妊婦のマラリア予防および管理実践に及ぼす影響を、i) 産前ケア訪問へのアクセス、ii) IPTp の投与、iii) 発熱時の医療機関の受診行動、iv) 医療提供者という観点から評価する。国内外のガイドラインの遵守、v) 2022 年 3 月から 2023 年 6 月までの期間、オヤム地区とコール地区における殺虫剤処理ネットの供給と使用、および屋内残留散布。
2. 2022年3月から2023年6月までの期間、オヤムとコール地区の研究コホートにおける症候性および重度のマラリアの発生率を評価する。
3. 2022年3月から2023年6月までの期間、オヤム地区とコール地区の妊婦におけるマラリアの予防と管理コンプライアンスの決定要因を評価します。
4. 2022年3月から2023年6月までの期間、オヤム地区とコール地区におけるマラリア関連の有害な母子転帰（母体貧血、母体死亡率、中絶、低出生体重児、未熟児、周産期死亡率、胎盤マラリア）の発生率を評価する。
5. 2022年3月から2023年6月までの期間、オヤム地区とコール地区の妊婦におけるSARS-CoV2感染症とマラリアに関する考えと知識を評価する。
6. 2022年3月から2023年6月までの期間、オヤムおよびコール地区の研究コホートにおける無症候性熱帯熱マラリア原虫感染症の有病率を評価します。
7. 熱帯熱マラリア原虫の dhfr および dhps 遺伝子の多型を記述することで、循環している dhfr および dhps ハプロタイプの状態を評価し、研究コホートおよび診断された患者集団におけるピリメタミンおよびスルファドキシン耐性に関連する dhfr / dhps 複合変異ハプロタイプの有病率を推定します。 2022年6月から2024年5月までのオヤム・コール地区におけるマラリア。

8. 2022年6月から2024年5月までの期間にオヤムとコール地区でマラリアと診断された研究コホートおよび患者集団における熱帯熱マラリア原虫ケルチ13遺伝子の多型分析により、アルテミシニン耐性の出現と局所的広がりを評価する。

   2.0 方法と材料 2.1 研究デザイン: これは、定量的なデータ収集方法を使用した、医療施設ベースの前向き観察研究になります。 データを収集するために、半構造化されたアンケートが実施されます。 データは、出産まで産前ケアを受診する妊婦のコホートを追跡し、前向きに収集されます。 また、マラリアと診断された非妊娠者の部分集団が耐性検出のために募集される。 収集されたデータは、産前ケアへのアクセス、IPTpの投与、発熱時の医療機関を求める行動、殺虫剤処理ネットの使用と屋内残留噴霧、アイデアの作成、およびSARS-CoV2感染症とマラリアに関する知識。

   2.2 研究の設定 この研究は、ランゴ地域のオヤム地区とコール地区にあるアバー病院および選択された医療施設で実施されます。 病院と地区保健センターは両方とも NGO Doctors with Africa CUAMM によって管理されています。

   セント ジョンズ病院アバーは、ローマ カトリック教のリラ教区が所有する民間の非営利の地域病院であり、ウガンダ カトリック医療局の認定を受けています。 この病院は、宗教団体である聖母マリア修道会によって管理されています。 病院のベッド数は 220 床です。 アバー病院の年間外来患者数は 27,827 人で、入院者数は 6,800 人でベッド占有率は約 40%、年間平均出産件数は 1,700 件で帝王切開率は 21% です。

   オヤム地区はウガンダ北部に位置します。 総人口は366,200人です。 北はグル県、南西はキリアンドンゴ県、西はヌウォヤ県、南はアパック県、東はコレ県に隣接しています。 この地区は 12 のサブ郡で構成されています。 ロロ、ミナクル、アベル、アカバ、ンガイ、アイスム、オトワル、アボク、ミェネ、アレカ、カムディニ、オヤム町議会。 コール地区は東にリラ地区、南にアパック地区、西と北にオヤム地区に隣接しています。 地区の首都であるコールは、準地域最大の都市であるリラの北西、道路で約 28 キロ (17 マイル) に位置しています。 コール地区は、アボケ郡、アカロ郡、アリト郡、エアー郡、バラ郡、オクウェドット郡、エアー郡議会に細分されています。

   2.3 サンプリング手順とサンプル サイズの推定 2.3.1 サンプル サイズの推定 抵抗検出

   それを考慮すると:

   • 無症状の妊婦における寄生虫血症の予想有病率は 5%
   • 発熱している妊婦における寄生虫血症の予想有病率は 13% です。
   • 2019年、耐性に関連する遺伝子多型を保有する熱帯熱マラリア原虫の有病率は、アルテミシニン誘導体で20%、SPで16%でした。

   熱帯熱マラリア原虫の陽性率を絶対精度 2%、検出力 80%、有意水準 5% (両側) で推定するには、10 人の妊婦を考慮して、最低 800 人の妊婦が必要になります。追跡までの % の損失。 研究者らは、増加傾向を考慮しても、約20の耐性を検出するには、寄生虫学的状態が不明な1200～1400人の女性を募集する必要がある。

   最小サンプルサイズの達成をサポートするために、研究者はアバー病院から顕微鏡で確認された非妊娠のマラリア患者の部分集団を採用する必要があります。 この追加の募集は、顕微鏡で確認された熱帯熱マラリア原虫感染サンプルの最小サンプルサイズ 300 に達するまで、連続登録することによって実行されます。

   妊婦のコホート 研究対象集団は、2022 年 5 月 1 日から 2023 年 6 月 30 日までの連続サンプリングによって募集されます。

   2.3.2 サンプリング手順

   医療施設は目的のあるサンプリングによって選択されます。 サンプリングは次の基準に基づいて行われます。

   • 研究室の能力
   • 経験豊富な顕微鏡医の存在
   • 産前ケアの訪問回数が月に少なくとも 50 回であること
   • 定期的な CUAMM 評価によるサービス品質

   2.3.3 参加者の選択 抽出された医療施設に来て適格基準を満たす参加者が研究に含まれます。 参加者の連続登録は、研究に必要な最小サンプルサイズが満たされるまで行われます。

   2.7 研究手順とスケジュール

   2.7.1 研究手順 顕微鏡検査 厚い血液塗抹標本と薄い血液塗抹標本を 2% ギムザで染色し、経験豊富な検査技師が読み取ります。 寄生虫密度は、白血球数を 8,000/μl と仮定して、白血球 200 個あたり (または白血球 200 個あたり無性寄生虫 10 個未満の場合は、白血球 500 個あたり) の無性寄生虫の数を数えることによって計算されます。 100 の高倍率視野の検査で無性寄生虫が検出されない場合、血液塗抹標本は陰性とみなされます。 配偶子赤血球血症は、厚い塗抹標本からも判定されます。 薄い塗抹標本は寄生虫の種の識別に使用されます。

   分子診断とマラリア原虫種の確認 患者の血液サンプルは、医療施設への入院中に濾紙 (Whatman 3 MM) を使用して収集されます。 乾燥血液スポット (DBS) は、指の針を刺してろ紙上に収集され (参加者あたり 3 滴の血液)、乾燥させて、乾燥剤とともにビニール袋に入れて保存し、保管する前に室温で涼しく乾燥した場所の箱に保管します。分子診断と薬剤耐性分析のためにISSに移送されました。

   血液サンプルの発送 収集された血液サンプルは、高度な多型分析のためにイタリアに発送されます。 輸送中、すべてのサンプルは乾燥した涼しい場所で室温でイタリア国立衛生研究所 (Istituto Superiore di Sanità、ISS) に保管されます。

   多型の高度な分析 メーカーの推奨に従って、PureLink Genomic DNA Kits-Invitrogen を使用して、フィルター ブロット (3MM Whatman) から全ゲノム DNA を抽出します。 寄生虫の同定は、18S rRNA 遺伝子をターゲットとするネステッド PCR アッセイに基づいています。 18S rRNA 遺伝子は、各プラスモディウム種の高度に保存された領域と可変領域の両方を含むため、ターゲットとして使用されます。 属特異的 PCR の後に、プラスモディウム種特異的 PCR 増幅が続きます。 2 回目の PCR からのアンプリコンは 2% アガロースゲルでの電気泳動によって分離され、紫外線トランスイルミネーションを使用して視覚化するために臭化エチジウムで染色されます。 寄生虫血症の存在は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、マラリア原虫、卵形マラリア原虫に対応する予想されるバンド サイズが特定されたときに確認されます。

   熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性の評価。 標的熱帯熱マラリア原虫薬剤耐性遺伝子: Pfk13 プロペラ、Pfdhfr および Pfdhps。 Pfk13 遺伝子のプロペラ ドメインの多型解析は、PCR 増幅とその後の配列決定によって実行されます。 コドン51、59、108のPfdhfr遺伝子およびコドン位置436、437、540、581、613のPfdhps遺伝子の分析は、増幅およびその後のサンガー配列決定によって行われます。 Pfk13 の市販のオリゴヌクレオチド プライマー ペアは Taylor らの論文に基づいて入手されますが、dhfr および dhps 遺伝子の分析用のプライマー ペアは Menegon らの論文に基づいて入手されます。 [31]。 得られた配列は、Accelrys DS Gene ソフトウェアによってコンパイルおよび分析されます。 PlasmoDB 遺伝子識別番号 PF3D7_1343700 (P. 熱帯熱マラリア原虫 3D7 株）は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の位置の番号付けの参考として使用されます。 分子研究は研究目的のみに実施され、研究患者の臨床管理には影響を与えません。

   地域の能力開発を強化するために、アーバー病院の検査担当者 1 名がイタリアの参考検査施設で 2 週間の曝露に参加します。

   研究時点 時点 研究手順とデータ収集の募集（ANC訪問） - 人口統計に関する情報を収集するために、訓練を受けた医療従事者によって実施される完全なアンケート。 年齢、居住地域）、社会経済的要因（例： 学歴、職業）、過去の妊娠の数と結果、最終月経日、蚊帳の所有と使用、マラリア化学予防の遵守、遵守しない理由、マラリア行動、IPTp 投与の障壁、ITN の使用、認知された影響新型コロナウイルス感染症（COVID-19）が投与されます。

   • 定期的な測定（体重、身長、聴診、血圧、体温など）とともに、女性の一般的な健康状態と栄養状態を評価する臨床検査。 在胎週数は、利用可能な場合は産科超音波検査によって評価され、利用できない場合は経験豊富な助産師による骨盤検査によって評価されます。

   • 以下のように分析される血液サンプルの収集:

     • 顕微鏡によるマラリア診断検査。陽性の場合は寄生虫数を検査します。 陽性サンプルはISSに送られる。 顕微鏡検査の結果を確認し、プラスモディウム種を識別するために分子診断が実行されます。 熱帯熱マラリア原虫陽性サンプルは、アルテミシニンおよび SP 耐性に関連する熱帯熱マラリア原虫遺伝子の一塩基多型の検出のために分析されます。 マラリアと診断された女性はウガンダの臨床ガイドラインに従って治療および経過観察され、寄生虫血症は3日目に再評価される。
     • HIV 診断検査。
     • ヘモグロビンレベル。 研究参加時にHIV陽性であることが判明したすべての女性は、さらなる評価と治療のために紹介されます。

   ANC訪問

   • 身体検査
   • 追跡調査では、発熱の病歴、マラリア関連の予防態度（IPTpの遵守、ITNの使用）、および新型コロナウイルス感染症のパンデミックによる介護を求める際の最終的な障壁を調査します。
   • 顕微鏡によるマラリア診断検査。陽性の場合は寄生虫数を検査します。 陽性サンプルはISSに送られる。 顕微鏡検査の結果を確認し、プラスモディウム種を識別するために分子診断が実行されます。 熱帯熱マラリア原虫陽性サンプルは、アルテミシニンおよび SP 耐性に関連する熱帯熱マラリア原虫遺伝子の一塩基多型の検出のために分析されます。 マラリアと診断された女性はウガンダの臨床ガイドラインに従って治療および経過観察され、寄生虫血症は3日目に再評価される。

   妊娠および/またはマラリアに関連した任意の自発的来院

   • 標準化された歴史
   • 体温、脈拍、血圧の測定などの身体検査。
   • 発熱している参加者（鼓膜温 > 38.0 ℃）、または過去 24 時間以内に発熱歴を報告した参加者は、濃厚な血液塗抹標本を得るために指で針を刺して血液を採取します。 濃厚な血液塗抹標本が陽性の場合、患者はマラリアと診断されます。 濃厚な血液塗抹標本が陰性の場合、患者は治験医師によって非マラリア性発熱性疾患として管理されます。 患者が無熱で、最近発熱を報告していない場合、定期的な検査スケジュールに従わない限り、濃い血液塗抹標本は得られません。
   • 顕微鏡検査で熱帯熱マラリア原虫の陽性反応が出た患者では、DBS として採取された最初の治療前の血液サンプルが、分子診断の確認と ISS に対する抗マラリア薬耐性の遺伝子分析のために送られます。 さらに、これらの患者では、WHOのプロトコルに従って、寄生虫血症が3日目に再評価されます。
   • 妊娠していない個人の部分母集団の募集はこの時点で開始されます。

   配達

   • 分娩情報：研究スタッフは、日時、分娩の種類、推定失血量、母体、産科、新生児の合併症など、分娩の詳細を文書化します。
   • 胎児の結果。
   • 乳児の情報: 校正された体重計によるアプガースコアと出生体重。 出産の際、女性は国のガイドラインに基づいた迅速な HIV 検査を繰り返し受けます。 女性が妊娠中に HIV に感染したことが判明した場合、母親と新生児の両方が研究から除外され、地域の母子感染予防ガイドラインに従って直ちに治療を受けることになります。

   2.8 データ収集と管理 2.8.1 データ収集ツール データは半構造化質問者を使用して収集され、イタリア、ローマの「カトリック聖心大学」でホストされる REDCap 電子データ キャプチャ ツール (研究電子データ キャプチャ) を使用して管理されます。研究研究のためのデータ キャプチャをサポートするように設計された安全な Web ベースのソフトウェア プラットフォームで、1) 検証済みのデータ キャプチャのための直感的なインターフェイスを提供します。 2) データ操作とエクスポート手順を追跡するための監査証跡。 3) 共通の統計パッケージにシームレスにデータをダウンロードするための自動エクスポート手順。 4) データ統合および外部ソースとの相互運用性の手順。

   2.8.2 抗マラリア薬耐性データの管理 データは標準的な研究データ収集フォームに記録され、正確性と完全性が審査されます。 データ フォームのエラー/欠落値が解決されると、フォームはデータ入力できる状態になります。 得られた結果はデー​​タベースに入力されます。 研究データのデータ入力と管理に対応するデータベースが開発されます。 データベースは、Microsoft Access などの標準のデータ管理ソフトウェア パッケージを使用して作成されます。 学習フォームごとにファイルが作成されます。 配列決定されたサンプルの分析により、関連する薬剤耐性 SNP およびその他すべての SNP (エキソンおよびイントロン) の個別の Excel データシートおよびマップなど、多数の標準化されたレポートが生成されます。 さらに、個別のサンプル バリアント コール フォーマット (VCF) ファイルが生成されます。

   2.8.3 新型コロナウイルス感染症の緩和策:

   研究者らは、研究期間のほとんどの間、新型コロナウイルス感染症のリスクが続くことを知っています。 データ収集と管理活動を含むすべての研究手順は、この理解を念頭に置いて実施され、次の新型コロナウイルス感染症のリスク軽減策が講じられます。

   • すべての研究スタッフは、保健省 (MOH) から通知された新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の標準作業手順 (SOP) を指導されます。
   • オリエンテーション会議は、新型コロナウイルス感染症予防プロトコルに沿って保健省が推奨する参加者数に従って行われます。
   • 研究者は、オンライン会議にZoomプラットフォームを定期的に使用して、研究施設全体での研究の進捗状況を更新するものとします。
   • 研究スタッフと参加者には、研究活動を実施する際に使用する新型コロナウイルス感染症対策の個人用保護具（マスク、手指消毒剤、手洗い石鹸）が提供されます。
   • 新型コロナウイルス感染症予防プロトコルは、すべての研究活動分野で公開、表示され、遵守され、必須サービスへのアクセスの継続を確保するためにも、導入コミュニケーションの一環として参加者の注意がこれらのプロトコルに向けられます。
   • すべての研究スタッフと参加者には適切な情報が提供され、保健省の推奨に従って新型コロナウイルスワクチン接種を受けることが奨励されます。

   2.11 倫理的考慮 研究計画書は、承認を得るためにラコール病院研究倫理委員会およびウガンダ国家科学技術評議会 (UNCST) に提出されます。 妊娠中の女性は、研究への参加について書面によるインフォームドコンセントを求められます。 当社は 2 つのレベルで同意を管理します。まず、研究への参加についての同意を取得し、その後、血液サンプルの収集とイタリアへの輸送についての同意を取得します。 収集された血液サンプルはこの研究の目的にのみ使用され、現在の研究プロジェクトを超えて保管されることはありません。 すべての未処理の血液サンプルは、プロジェクトの終了時に生物学的衛生廃棄物としてイタリア・バーリ大学感染症学部から廃棄されます。 参加の有無にかかわらず、すべての妊婦に同じ標準的なケアが保証されます。 研究参加者の尊厳は、データの機密性と、いつでもデータおよび/または生物学的サンプルを撤回する権利と同様に、研究者によって保証されます。 妊娠中の女性および成人し解放された未成年者への同意は、ウガンダの被験者保護ガイドラインに従って取得されます。

   本研究で分子分析のために処理されたすべてのマラリア陽性サンプルについては、医療機密性とプライバシーを適切に保護するために、個人を特定する情報が削除されます。 このようにして、機密データを特定可能な被験者にリンクしたり再リンクしたりすることはできず、処理された各サンプルは匿名になります。

   Pfk13 遺伝子のプロペラ ドメインの多型解析は、高度に専門化された科学実験室で高度な増幅技術とその後のサンガー配列決定によって実行されます。 この研究で収集された血液サンプルは、最新の Pfk13 遺伝子増幅技術を利用するために、イタリアのバーリ大学の研究室に送られます。 地域の能力構築を強化するために、アーバー病院の検査スタッフ 1 名が、イタリアの参考検査施設での 2 週間の曝露に参加するようサポートされます。 イタリアへの血液サンプル輸送の許可: イタリアへの血液サンプルの出荷前に、サンプル輸送の承認が UNCST から取得されます。イタリア。 血液サンプルの転送の要請は、UNCST の事務局長に書面で行われます。 これには、ポープ・ジョン病院アベル（譲渡者）、ドクターズ・ウィズ・アフリカCUAMM（研究パートナー）、およびバーリ大学感染症学部（受取人）の間の物質移転協定（MTA）が伴います。 移送条件の正確な仕様および承認された研究プロトコールも、血液サンプルの移送要求とともに UNCST に提出されます。