クローン病患者における抵抗性肛門周囲瘻の治療のための胎盤間葉系幹細胞由来エクソソームの注射の安全性

私たちの研究に登録されたすべての患者は難治性疾患を患っていました。 これらの患者は以前に治療を受けており、未治癒の停留腺瘻を持っていました。 この研究に登録された患者は、静脈内インフリキシマブ 10 mg/kg の投与とシートン留置後に何の改善も見られなかった患者でした。 抗 TNF α 治療が 6 か月未満の場合、以前に外科的介入を受けていない場合、または悪性腫瘍または免疫不全疾患の病歴がある場合、患者は除外されました。 妊娠中の患者も除外されました。

第 3 継代 3 の MSC は、T175 フラスコで、Pen/Strep、Strep、および 10 % エキソソーム枯渇 FBS (Gibco) を添加した D-MEM F12 培地 (Gibco) を使用して、37 °C、CO2 濃度 5 で 48 時間培養しました。 90 % の湿度の % および湿度。 CO25%以下。 ＭＳＣ（ＣＭ）の馴化培地を収集し、４００×ｇで１０分間遠心分離して浮遊細胞を除去し、２５００×ｇで３０分間遠心分離して破片およびアポトーシス小体を除去し、次いで１０００００×ｇで１２０分間超遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ、アメリカ合衆国）。 上清を回収し、さらに100000×gで120分間超遠心分離した。 次に、エキソソームを含むペレットを PBS に溶解しました。

MSC 由来のエキソソームの産生を確認するために、100 ml の CM からブラッドフォード比色アッセイ (BCA) によって小胞タンパク質含有量を測定しました。 MSC 由来のエキソソームのサイズ分布は、動的光散乱 (DLS) によって決定されました。 さらに、CD9、CD63およびCD81の発現を評価するために、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットで確認しました。 さらに、分離されたエキソソームの形態とサイズは、以前の研究で以前に設定されたプロトコルによって TEM を使用して評価されました。

処置は手術室で行われ、患者は手術の 6 時間前に静脈内鎮静とマスクによる酸素補給を行った NPO でした。 配置された患者は、砕石位に配置された。 外瘻の開口部を検査し、管を触診し、アイゼンハンマー開創器を使用して、内部の開口部を露出させました。 小さなカテーテルを使用してロットを生理食塩水で数回洗浄し、膿と糞便を除去しました。 灌注後、柔軟な瘻孔プローブを管に挿入した。 プローブをガイドとして使用して、5 mL のエクソソーム溶液をロットの周囲の組織に注入しました。 注射の深さは、肛門の軟部組織および括約筋の約２～３ｍｍであった。 注入後、トラクトプローブを抜き取り、手術回復室回復室で患者を３時間観察し、バイタルサインをモニターした。 その後、患者は外科病棟に移され、48時間観察されました。 患者は、注射の6か月後に、さらに評価するために、手術室で鎮静下で再度検査されました。