Segurança da injeção de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais da placenta para tratamento de fístula perianal resistente em pacientes com doença de Crohn

Todos os pacientes incluídos em nosso estudo apresentavam doença refratária. Esses pacientes foram previamente tratados e apresentavam fístulas criptoglandulares não cicatrizadas. Os pacientes incluídos neste estudo foram aqueles que não apresentaram nenhuma melhora após a administração de 10 mg/kg de infliximabe intravenoso e colocação de seton. Os pacientes foram excluídos se estivessem em tratamento com anti-TNF α por menos de seis meses, sem intervenções cirúrgicas prévias ou com história de doenças malignas ou imunodeficientes. Pacientes grávidas também foram excluídas.

As MSCs na terceira passagem 3 foram cultivadas em frascos T175 com meio de cultura D-MEM F12 (Gibco) suplementado com Pen/Strep, Strep e 10% de FBS sem exossomos (Gibco) por 48 horas a 37 °C com uma concentração de CO2 de 5 % em e umidade de 90 % de umidade. Abaixo de 5% de CO2. Os meios condicionados de MSCs (CM) foram coletados e centrifugados por 10 min a 400 × g para eliminar as células suspensas, 30 min a 2500 × g para remover detritos e corpos apoptóticos e, em seguida, ultracentrifugado por 120 min a 100000 × g (Beckman, EUA). Os sobrenadantes foram coletados e posteriormente ultracentrifugados por 120 min a 100.000 × g. Em seguida, os pellets contendo exossomos foram dissolvidos em PBS.

Para verificar a produção de exossomos derivados de MSC, o conteúdo de proteína da vesícula foi medido pelo ensaio colorimétrico de Bradford (BCA) a partir de 100 ml de CM. A distribuição de tamanho de exossomos derivados de MSC foi determinada por dispersão de luz dinâmica (DLS). Além disso, para avaliar a expressão de CD9, CD63 e CD81 foram confirmados com citometria de fluxo e western blot., Anti-CD63 de camundongo FITC (BD Pharmingen) e anti-CD81 de camundongo PE (BD Pharmingen) foram usados ​​como reagentes. Além disso, a morfologia e o tamanho dos exossomos isolados foram avaliados usando TEM pelo protocolo previamente definido no estudo anterior.

O procedimento foi realizado na sala de operação e os pacientes foram NPO 6 horas antes da operação com sedação endovenosa e suplementação de oxigênio com máscara. Os pacientes colocados foram colocados em posição de litotomia. Inspecionou-se a abertura externa da fístula, palpou-se o trajeto e, com o auxílio de um retrator de Eisenhammer, expôs-se o orifício interno. O lote foi irrigado com solução salina várias vezes usando um pequeno cateter para limpar o pus e o material fecal. Após a irrigação, uma sonda de fístula flexível foi inserida no trato. Usando a sonda como guia, injetamos 5 mL de solução de exossomo no tecido ao redor do lote. A profundidade da injeção foi de cerca de 2-cerca de 2-3 mm do tecido mole e esfíncteres do ânus. Após a injeção, a sonda do trato foi extraída, os pacientes ficaram em observação na sala de recuperação da sala de recuperação da operação por 3 horas, e os sinais vitais foram monitorados. Os pacientes foram então transferidos para a ala cirúrgica e foram observados por 48 horas. Os pacientes foram novamente examinados sob sedação na sala de operação para avaliação posterior seis meses após a injeção.