Bezpečnost injekce exozomů odvozených z placentárních mezenchymálních kmenových buněk pro léčbu rezistentní perianální píštěle u pacientů s Crohnovou chorobou

Všichni pacienti, kteří byli zařazeni do naší studie, měli refrakterní onemocnění. Tito pacienti byli dříve léčeni a měli nezhojené kryptoglandulární píštěle. Pacienti, kteří byli zařazeni do této studie, byli ti, u kterých nedošlo k žádnému zlepšení po podání 10 mg/kg intravenózního infliximabu a umístění setonu. Pacienti byli vyloučeni, pokud měli anti-TNF α léčbu po dobu kratší než šest měsíců, neměli žádné předchozí chirurgické zákroky nebo měli v anamnéze malignity nebo imunodeficitní onemocnění. Vyloučeny byly také těhotné pacientky.

MSC ve třetí pasáži 3 byly kultivovány v baňkách T175 s kultivačním médiem D-MEM F12 (Gibco) doplněným o Pen/Strep, Strep a 10 % exosom zbavený FBS (Gibco) po dobu 48 hodin při 37 °C s koncentrací CO2 5 % at a vlhkosti 90 % vlhkosti. Pod 5 % CO2. Kondicionovaná média MSC (CM) byla shromážděna a centrifugována po dobu 10 minut při 400 x g, aby se odstranily suspendované buňky, 30 minut při 2500 x g, aby se odstranily zbytky a apoptotická tělíska, a poté ultracentrifugována po dobu 120 minut při 100 000 x g (Beckman, USA). Supernatanty byly shromážděny a dále ultracentrifugovány po dobu 120 minut při 100 000 x g. Poté byly pelety obsahující exosomy rozpuštěny v PBS.

Pro ověření produkce exozomů odvozených od MSC byl obsah vezikulového proteinu měřen Bradfordovým kolorimetrickým testem (BCA) ze 100 ml CM. Distribuce velikosti exosomů odvozených od MSC byla určena dynamickým rozptylem světla (DLS). Kromě toho, pro hodnocení exprese CD9, CD63 a CD81 byly potvrzeny průtokovou cytometrií a western blotem, byly jako reagencie použity FITC myší anti-CD63 (BD ​​Pharmingen) a PE myší anti-CD81 (BD Pharmingen). Dále byla morfologie a velikost izolovaných exozomů hodnocena pomocí TEM podle dříve stanoveného protokolu v předchozí studii.

Výkon byl proveden na operačním sále a pacienti byli 6 hodin před operací NPO s nitrožilní sedací a suplementací kyslíku maskou. Uložení pacienti byli umístěni do litotomické polohy. Otevření vnější píštěle bylo prohlédnuto, trakt byl prohmatán a pomocí Eisenhammerova retraktoru byl odkryt vnitřní otvor. Šarže byla několikrát propláchnuta fyziologickým roztokem pomocí malého katetru, aby se odstranil hnis a fekální materiál. Po irigaci byla do traktu zavedena flexibilní sonda pro píštěle. Pomocí sondy jako vodítka jsme vstříkli 5 ml roztoku exosomu do tkáně obklopující šarži. Hloubka injekce byla asi 2 až 2 až 3 mm měkké tkáně a svěračů řitního otvoru. Po injekci byla traktová sonda extrahována, pacienti byli 3 hodiny pozorováni na zotavovacím pokoji po operaci a byly sledovány vitální funkce. Poté byli pacienti převezeni na chirurgické oddělení a byli sledováni po dobu 48 hodin. Pacienti byli opět vyšetřeni v sedaci na operačním sále k dalšímu hodnocení šest měsíců po injekci.