Sikkerhet ved injeksjon av placenta mesenkymale stamcelle-avledede eksosomer for behandling av resistente perianale fistel hos Crohns pasienter

Alle pasienter som ble inkludert i vår studie hadde refraktær sykdom. Disse pasientene ble tidligere behandlet og hadde uhelte kryptoglandulære fistler. Pasientene som ble inkludert i denne studien var de som ikke gjorde noen forbedring etter administrering av 10 mg/kg intravenøs infliksimab og setonplassering. Pasienter ble ekskludert hvis de hadde anti-TNF α-behandling i mindre enn seks måneder, ikke hadde tidligere kirurgiske inngrep eller hadde en historie med maligniteter eller immunsviktsykdommer. Gravide pasienter ble også ekskludert.

MSC-er i tredje passasje 3 ble dyrket i T175-kolber med D-MEM F12-kulturmedium (Gibco) supplert med Pen/Strep, Strep og 10 % exosom-utarmet FBS(Gibco) i 48 timer ved 37 °C med en CO2-konsentrasjon på 5 % ved og fuktighet på 90 % fuktighet. Under 5 % CO2. Det kondisjonerte mediet av MSC-er (CM) ble samlet og sentrifugert i 10 minutter ved 400 × g for å eliminere suspenderte celler, 30 minutter ved 2500 × g for å fjerne rusk og apoptotiske legemer, og deretter ultrasentrifugert i 120 minutter ved 100 000 × g (Beckman, USA). Supernatantene ble samlet og ytterligere ultrasentrifugert i 120 minutter ved 100 000 xg. Deretter ble pellets inneholdende eksosomer oppløst i PBS.

For å verifisere produksjonen av MSC-avledede eksosomer, ble vesikkelproteininnholdet målt ved Bradford kolorimetrisk analyse (BCA) fra 100 ml CM. Størrelsesfordelingen til MSC-avledede eksosomer ble bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS). Dessuten, for å vurdere uttrykket av CD9, ble CD63 og CD81 bekreftet med flowcytometri og western blot., FITC mus anti-CD63 (BD ​​Pharmingen) og PE mus anti-CD81 (BD Pharmingen) ble brukt som reagenser. Videre ble morfologien og størrelsen til isolerte eksosomer vurdert ved bruk av TEM ved den tidligere angitte protokollen i forrige studie.

Prosedyren ble foretatt på operasjonsrommet, og pasientene var NPO 6 timer før operasjonen med intravenøs sedasjon og oksygentilskudd med maske. Pasientene ble plassert i litotomistilling. Den ytre fistelåpningen ble inspisert, kanalen ble palpert, og ved bruk av en Eisenhammer Retractor ble den indre åpningen synlig. Partiet ble vannet med saltvann flere ganger ved hjelp av et lite kateter for å fjerne puss og fekalt materiale. Etter vanning ble en fleksibel fistelsonde satt inn i kanalen. Ved å bruke sonden som en veiledning injiserte vi 5 mL eksosomløsning i vevet som omgir partiet. Injeksjonsdybden var ca. 2-3 mm av bløtvevet og lukkemusklene i anus. Etter injeksjonen ble tarmsonden trukket ut, pasientene var under observasjon i operasjonsstuen i 3 timer, og vitale tegn ble overvåket. Pasientene ble deretter overført til operasjonsavdelingen og ble observert i 48 timer. Pasientene ble igjen undersøkt under sedasjon på operasjonsrommet for videre evaluering seks måneder etter injeksjon.