크론병 환자의 항문주위 누공 치료를 위한 태반간엽줄기세포 유래 엑소좀 주입의 안전성

우리 연구에 등록한 모든 환자는 난치성 질환을 가졌습니다. 이 환자들은 이전에 치료를 받았고 치유되지 않은 잠복선 누공을 가지고 있었습니다. 본 연구에 등록한 환자는 infliximab 10 mg/kg 정맥주사 및 세톤 배치 후에도 호전이 없는 환자였다. 환자가 6개월 미만 동안 항-TNF α 치료를 받았거나 이전에 외과적 개입이 없었거나 악성 종양 또는 면역결핍 질환의 병력이 있는 환자는 제외되었습니다. 임산부도 제외됐다.

세 번째 계대 3의 중간엽 줄기세포는 Pen/Strep, Strep 및 10% 엑소좀 제거 FBS(Gibco)가 보충된 D-MEM F12 배양 배지(Gibco)가 있는 T175 플라스크에서 48시간 동안 37°C에서 CO2 농도 5로 배양되었습니다. % at 및 습도 90% 습도. CO2 5% 미만. 중간엽 줄기세포(CM)의 조정 배지를 수집하고 400xg에서 10분 동안 원심분리하여 부유 세포를 제거하고, 2500xg에서 30분 동안 파편 및 세포사멸체를 제거한 다음, 100000xg에서 120분 동안 초원심분리했습니다(Beckman, 미국). 상등액을 수집하고 100000 xg에서 120분 동안 추가 초원심분리하였다. 그런 다음 엑소좀을 포함하는 펠릿을 PBS에 용해시켰다.

MSC 유래 엑소좀의 생성을 확인하기 위해 100ml의 CM에서 Bradford colorimetric assay(BCA)로 소포체 단백질 함량을 측정하였다. MSC 유래 엑소좀의 크기 분포는 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정되었습니다. 또한, CD9의 발현을 평가하기 위해 CD63과 CD81을 유세포 분석법과 western blot으로 확인하였고, 시약으로는 FITC mouse anti-CD63(BD Pharmingen)과 PE mouse anti-CD81(BD Pharmingen)을 사용하였다. 또한, 분리된 엑소좀의 형태 및 크기는 이전 연구에서 이전에 설정된 프로토콜에 의해 TEM을 사용하여 평가되었습니다.

수술은 수술실에서 진행하였으며, 환자는 수술 6시간 전부터 NPO 상태로 정맥 진정제 투여와 마스크를 이용한 산소 공급을 시행하였다. 배치된 환자는 쇄석술 위치에 배치되었습니다. 외부 누공 개구부를 검사하고 관을 촉진하고 Eisenhammer Retractor를 사용하여 내부 구멍을 관찰했습니다. 작은 카테터를 사용하여 로트를 식염수로 여러 번 세척하여 고름과 배설물을 제거했습니다. 세척 후 유연한 누공 탐침을 관에 삽입했습니다. 프로브를 가이드로 사용하여 5mL의 엑소좀 용액을 로트 주변 조직에 주입했습니다. 주사 깊이는 항문의 연조직과 괄약근의 약 2~3mm 정도였다. 주사 후 관 탐침을 적출하고 수술회복실 회복실에서 3시간 동안 환자를 관찰하며 활력징후를 관찰하였다. 이후 환자들은 수술 병동으로 옮겨져 48시간 동안 관찰되었다. 환자들은 주사 후 6개월 후에 추가 평가를 위해 수술실에서 진정 상태에서 다시 검사를 받았습니다.