Sikkerhed ved injektion af placenta mesenkymale stamcelle-afledte exosomer til behandling af resistente perianale fistel hos Crohns patienter

Alle patienter, der var inkluderet i vores undersøgelse, havde refraktær sygdom. Disse patienter var tidligere behandlet og havde uhelede kryptoglandulære fistler. De patienter, der blev inkluderet i denne undersøgelse, var dem, der ikke opnåede nogen forbedring efter administration af 10 mg/kg intravenøs infliximab og setonplacering. Patienter blev udelukket, hvis de havde anti-TNF α-behandling i mindre end seks måneder, ingen tidligere kirurgiske indgreb eller havde en historie med maligniteter eller immundefektsygdomme. Gravide patienter blev også udelukket.

MSC'er i tredje passage 3 blev dyrket i T175-kolber med D-MEM F12-kulturmedium (Gibco) suppleret med Pen/Strep, Strep og 10 % exosom-depleteret FBS(Gibco) i 48 timer ved 37 °C med en CO2-koncentration på 5 % ved og luftfugtighed på 90 % luftfugtighed. Under 5 % CO2. De konditionerede medier af MSC'er (CM) blev opsamlet og centrifugeret i 10 minutter ved 400×g for at eliminere suspenderede celler, 30 minutter ved 2500×g for at fjerne snavs og apoptotiske legemer og derefter ultracentrifugeret i 120 minutter ved 100000×g (Beckman, USA). Supernatanterne blev opsamlet og yderligere ultracentrifugeret i 120 minutter ved 100.000 xg. Derefter blev pellets indeholdende exosomer opløst i PBS.

For at verificere produktionen af ​​MSC-afledte exosomer blev vesikelproteinindholdet målt ved Bradford kolorimetrisk assay (BCA) fra 100 ml CM. Størrelsesfordelingen af ​​MSC-afledte exosomer blev bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS). For at vurdere ekspressionen af ​​CD9 blev CD63 og CD81 desuden bekræftet med flowcytometri og western blot. FITC muse anti-CD63 (BD ​​Pharmingen) og PE mus anti-CD81 (BD Pharmingen) blev brugt som reagenser. Desuden blev morfologien og størrelsen af ​​isolerede exosomer vurderet ved hjælp af TEM ved den tidligere fastsatte protokol i den tidligere undersøgelse.

Indgrebet blev foretaget på operationsstuen, og patienterne var NPO 6 timer før operationen med intravenøs sedation og ilttilskud med maske. Patienterne blev anbragt i en litotomiposition. Den ydre fistelåbning blev inspiceret, kanalen blev palperet, og ved hjælp af en Eisenhammer Retractor blev den indre åbning set blottet. Partiet blev skyllet med saltvand flere gange ved hjælp af et lille kateter for at rense pus og fækalt materiale. Efter vanding blev en fleksibel fistelsonde indsat i kanalen. Ved at bruge sonden som en guide injicerede vi 5 ml exosomopløsning i vævet omkring partiet. Injektionsdybden var ca. 2 ca. 2-3 mm af det bløde væv og lukkemusklerne i anus. Efter injektionen blev tarmsonden ekstraheret, patienterne var under observation i opvågningsstuen i operationsstuen i 3 timer, og vitale tegn blev overvåget. Patienterne blev derefter overført til operationsafdelingen og blev observeret i 48 timer. Patienterne blev igen undersøgt under sedation på operationsstuen til yderligere evaluering seks måneder efter injektionen.