Seguridad de la inyección de exosomas derivados de células madre mesenquimales placentarias para el tratamiento de la fístula perianal resistente en pacientes con enfermedad de Crohn

Todos los pacientes que se inscribieron en nuestro estudio tenían enfermedad refractaria. Estos pacientes fueron tratados previamente y tenían fístulas criptoglandulares no curadas. Los pacientes incluidos en este estudio fueron aquellos que no mejoraron después de la administración de 10 mg/kg de infliximab intravenoso y la colocación de sedal. Se excluyó a los pacientes que tenían menos de seis meses de tratamiento anti-TNF-α, no tenían intervenciones quirúrgicas previas o tenían antecedentes de enfermedades malignas o inmunodeficiencias. Las pacientes embarazadas también fueron excluidas.

Las MSC en el tercer paso 3 se cultivaron en matraces T175 con medio de cultivo D-MEM F12 (Gibco) complementado con Pen/Strep, Strep y FBS agotado en exosomas al 10 % (Gibco) durante 48 horas a 37 °C con una concentración de CO2 de 5 % a y humedad del 90 % de humedad. Menos del 5% de CO2. Los medios acondicionados de MSC (CM) se recolectaron y centrifugaron durante 10 min a 400 × g para eliminar las células suspendidas, 30 min a 2500 × g para eliminar los desechos y los cuerpos apoptóticos y luego se ultracentrifugaron durante 120 min a 100000 × g (Beckman, EE.UU). Los sobrenadantes se recogieron y se ultracentrifugaron durante 120 min a 100000 × g. Luego, los gránulos que contenían exosomas se disolvieron en PBS.

Para verificar la producción de exosomas derivados de MSC, se midió el contenido de proteína vesicular mediante ensayo colorimétrico de Bradford (BCA) a partir de 100 ml de CM. La distribución de tamaño de los exosomas derivados de MSC se determinó mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Además, para evaluar la expresión de CD9, CD63 y CD81 se confirmaron con citometría de flujo y western blot. Se usaron como reactivos anti-CD63 de ratón FITC (BD Pharmingen) y anti-CD81 de ratón PE (BD Pharmingen). Además, la morfología y el tamaño de los exosomas aislados se evaluaron mediante TEM mediante el protocolo establecido previamente en el estudio anterior.

El procedimiento se realizó en quirófano, y los pacientes fueron NPO 6 horas antes de la operación con sedación endovenosa y suplemento de oxígeno con mascarilla. Los pacientes colocados se colocaron en posición de litotomía. Se inspeccionó el orificio externo de la fístula, se palpó el trayecto y con un retractor de Eisenhammer se expuso el orificio interno. El lote fue irrigado con solución salina varias veces usando un pequeño catéter para limpiar el pus y la materia fecal. Después de la irrigación, se insertó una sonda de fístula flexible en el tracto. Usando la sonda como guía, inyectamos 5 ml de solución de exosomas en el tejido que rodea el lote. La profundidad de la inyección fue de unos 2-3 mm de los tejidos blandos y los esfínteres del ano. Después de la inyección, se extrajo la sonda del tracto, los pacientes estuvieron en observación en la sala de recuperación de recuperación de operaciones durante 3 horas y se monitorearon los signos vitales. Luego, los pacientes fueron trasladados a la sala de cirugía y fueron observados durante 48 horas. Los pacientes fueron examinados nuevamente bajo sedación en el quirófano para una evaluación adicional seis meses después de la inyección.