Bezpieczeństwo iniekcji egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych łożyska w leczeniu opornej przetoki okołoodbytniczej u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna

Wszyscy pacjenci włączeni do naszego badania mieli chorobę oporną na leczenie. Chorzy ci byli wcześniej leczeni i mieli niewygojone przetoki kryptogruczołowe. Do tego badania włączono pacjentów, u których nie nastąpiła żadna poprawa po podaniu dożylnym infliksymabu w dawce 10 mg/kg i umieszczeniu setonu. Pacjenci zostali wykluczeni, jeśli otrzymywali leczenie anty-TNF α przez mniej niż sześć miesięcy, nie mieli wcześniejszych interwencji chirurgicznych lub mieli w wywiadzie nowotwory złośliwe lub niedobory odporności. Wykluczono również pacjentki w ciąży.

MSC w trzecim pasażu 3 hodowano w kolbach T175 z pożywką hodowlaną D-MEM F12 (Gibco) uzupełnioną Pen/Strep, Strep i 10% FBS zubożonym w egzosom (Gibco) przez 48 godzin w 37 ° C przy stężeniu CO2 5 % at i wilgotność 90 % wilgotności. Poniżej 5% CO2. Kondycjonowaną pożywkę MSC (CM) zebrano i wirowano przez 10 minut przy 400 x gw celu wyeliminowania zawieszonych komórek, 30 minut przy 2500 x gw celu usunięcia szczątków i ciałek apoptotycznych, a następnie ultrawirowano przez 120 minut przy 100 000 x g (Beckman, USA). Supernatanty zebrano i dalej ultrawirowano przez 120 min przy 100000 x g. Następnie peletki zawierające egzosomy rozpuszczono w PBS.

Aby zweryfikować wytwarzanie egzosomów pochodzących z MSC, zmierzono zawartość białka w pęcherzykach za pomocą testu kolorymetrycznego Bradforda (BCA) ze 100 ml CM. Rozkład wielkości egzosomów pochodzących z MSC określono metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Ponadto do oceny ekspresji CD9, CD63 i CD81 potwierdzono metodą cytometrii przepływowej i western blot. Jako odczynniki zastosowano mysie anty-CD63 FITC (BD Pharmingen) i mysie anty-CD81 PE (BD Pharmingen). Ponadto morfologię i wielkość izolowanych egzosomów oceniono za pomocą TEM według wcześniej ustalonego protokołu w poprzednim badaniu.

Zabieg wykonywano w sali operacyjnej, a chorych na 6 godzin przed operacją poddano NPO z zastosowaniem sedacji dożylnej i suplementacji tlenem przez maskę. Umieszczonych pacjentów ułożono w pozycji litotomii. Zbadano zewnętrzne ujście przetoki, zbadano palpacyjnie przewód i za pomocą retraktora Eisenhammera odsłonięto ujście wewnętrzne. Partię kilkakrotnie przepłukiwano solą fizjologiczną przy użyciu małego cewnika w celu usunięcia ropy i kału. Po irygacji do przewodu wprowadzano elastyczną sondę do przetoki. Używając sondy jako przewodnika, wstrzyknęliśmy 5 ml roztworu egzosomu do tkanki otaczającej partię. Głębokość wstrzyknięcia wynosiła około 2 około 2-3 mm tkanki miękkiej i zwieraczy odbytu. Po wykonaniu wstrzyknięcia sondę przewodu pokarmowego usunięto, pacjentów obserwowano przez 3 godziny w sali pooperacyjnej po wybudzeniu i monitorowano parametry życiowe. Chorych następnie przenoszono na oddział chirurgiczny i obserwowano przez 48 godzin. Pacjentów ponownie zbadano w sedacji na sali operacyjnej w celu dalszej oceny sześć miesięcy po wstrzyknięciu.