Безопасность инъекции экзосом, полученных из плацентарных мезенхимальных стволовых клеток, для лечения резистентных перианальных свищей у пациентов с болезнью Крона

Все пациенты, включенные в наше исследование, имели рефрактерное заболевание. Эти пациенты ранее лечились и имели незаживающие криптогландулярные свищи. В это исследование были включены пациенты, у которых не наблюдалось никаких улучшений после введения 10 мг/кг инфликсимаба внутривенно и введения сетона. Пациенты были исключены, если они получали лечение анти-ФНО-α менее шести месяцев, не имели предшествующих хирургических вмешательств или имели в анамнезе злокачественные новообразования или иммунодефицитные заболевания. Беременные пациентки также были исключены.

МСК в третьем пассаже 3 культивировали в колбах T175 с культуральной средой D-MEM F12 (Gibco) с добавлением Pen/Strep, Strep и 10% обедненной экзосомами FBS (Gibco) в течение 48 часов при 37 °C с концентрацией CO2 5 % при и влажности 90 % влажности. Менее 5% CO2. Кондиционированные среды МСК (CM) собирали и центрифугировали в течение 10 минут при 400×g для удаления взвешенных клеток, 30 минут при 2500×g для удаления дебриса и апоптотических телец, а затем ультрацентрифугировали в течение 120 минут при 100000×g (Beckman, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Супернатанты собирали и далее ультрацентрифугировали в течение 120 мин при 100000×g. Затем осадки, содержащие экзосомы, растворяли в PBS.

Для проверки продукции экзосом, происходящих из МСК, содержание белка везикул измеряли с помощью колориметрического анализа Бредфорда (BCA) из 100 мл CM. Распределение размеров экзосом, полученных из МСК, определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS). Более того, для оценки экспрессии CD9, CD63 и CD81 подтверждали с помощью проточной цитометрии и вестерн-блоттинга. В качестве реагентов использовали мышиные анти-CD63 FITC (BD Pharmingen) и мышиные анти-CD81 PE (BD Pharmingen). Кроме того, морфологию и размер изолированных экзосом оценивали с помощью ПЭМ по ранее установленному протоколу в предыдущем исследовании.

Процедура была проведена в операционной, и пациенты были остановлены за 6 часов до операции с внутривенной седацией и кислородной подпиткой с помощью маски. Уложенных пациентов укладывали в положение для литотомии. Осматривали наружное свищевое отверстие, пальпировали ход и с помощью ретрактора Эйзенхаммера обнажали внутреннее отверстие. Партию несколько раз промывали физиологическим раствором с использованием небольшого катетера для удаления гноя и фекального материала. После промывания в ход вводили гибкий свищевой зонд. Используя зонд в качестве ориентира, мы вводили 5 мл раствора экзосом в ткани, окружающие участок. Глубина инъекции составляла около 2-3 мм мягких тканей и сфинктеров заднего прохода. После инъекции проводящий зонд извлекали, пациенты находились под наблюдением в течение 3 часов в палате реанимации и осуществлялся мониторинг основных показателей жизнедеятельности. Затем пациентов переводили в хирургическое отделение и наблюдали в течение 48 часов. Пациентов снова обследовали под седацией в операционной для дальнейшего обследования через шесть месяцев после инъекции.