Sicurezza dell'iniezione di esosomi derivati ​​​​da cellule staminali mesenchimali placentari per il trattamento della fistola perianale resistente nei pazienti di Crohn

Tutti i pazienti che sono stati arruolati nel nostro studio avevano una malattia refrattaria. Questi pazienti erano stati precedentemente trattati e presentavano fistole criptoghiandolari non cicatrizzate. I pazienti che sono stati arruolati in questo studio erano quelli che non hanno avuto alcun miglioramento dopo la somministrazione di 10 mg/kg di infliximab per via endovenosa e il posizionamento di seton. I pazienti sono stati esclusi se avevano ricevuto un trattamento anti-TNF α per meno di sei mesi, non avevano subito precedenti interventi chirurgici o avevano una storia di tumori maligni o malattie da immunodeficienza. Sono state escluse anche le donne in gravidanza.

Le MSC nel terzo passaggio 3 sono state coltivate in fiasche T175 con terreno di coltura D-MEM F12 (Gibco) integrato con Pen/Strep, Strep e FBS (Gibco) impoverito al 10% di esosomi per 48 ore a 37 °C con una concentrazione di CO2 di 5 % at e umidità del 90 % di umidità. Sotto il 5% di CO2. I mezzi condizionati di MSC (CM) sono stati raccolti e centrifugati per 10 min a 400×g per eliminare le cellule sospese, 30 min a 2500×g per rimuovere detriti e corpi apoptotici, e poi ultracentrifugati per 120 min a 100000×g (Beckman, STATI UNITI D'AMERICA). I supernatanti sono stati raccolti e ulteriormente ultracentrifugati per 120 minuti a 100000 × g. Quindi i pellet contenenti esosomi sono stati sciolti in PBS.

Per verificare la produzione di esosomi derivati ​​da MSC, il contenuto proteico della vescicola è stato misurato mediante saggio colorimetrico Bradford (BCA) da 100 ml di CM. La distribuzione delle dimensioni degli esosomi derivati ​​da MSC è stata determinata mediante diffusione dinamica della luce (DLS). Inoltre, per valutare l'espressione di CD9, CD63 e CD81 sono stati confermati con citometria a flusso e western blot., FITC mouse anti-CD63 (BD ​​Pharmingen) e PE mouse anti-CD81 (BD Pharmingen) sono stati usati come reagenti. Inoltre, la morfologia e le dimensioni degli esosomi isolati sono state valutate utilizzando TEM dal protocollo precedentemente impostato nello studio precedente.

La procedura è stata eseguita in sala operatoria e i pazienti erano NPO 6 ore prima dell'operazione con sedazione endovenosa e supplementazione di ossigeno con una maschera. I pazienti, collocati sono stati posti in posizione litotomica. L'apertura esterna della fistola è stata ispezionata, il tratto è stato palpato e, utilizzando un divaricatore Eisenhammer, è stato esposto l'orifizio interno. Il lotto è stato irrigato più volte con soluzione fisiologica utilizzando un piccolo catetere per eliminare il pus e il materiale fecale. Dopo l'irrigazione, è stata inserita nel tratto una sonda fistola flessibile. Usando la sonda come guida, abbiamo iniettato 5 mL di soluzione esosomica nel tessuto circostante il lotto. La profondità di iniezione era di circa 2 circa 2-3 mm dei tessuti molli e degli sfinteri dell'ano. Dopo l'iniezione, la sonda del tratto è stata estratta, i pazienti sono stati sotto osservazione nella camera di recupero dell'operazione per 3 ore e sono stati monitorati i segni vitali. I pazienti sono stati quindi trasferiti nel reparto di chirurgia e sono stati osservati per 48 ore. I pazienti sono stati nuovamente esaminati sotto sedazione in sala operatoria per un'ulteriore valutazione sei mesi dopo l'iniezione.