Sicherheit der Injektion von aus plazentalen mesenchymalen Stammzellen gewonnenen Exosomen zur Behandlung von resistenten perianalen Fisteln bei Patienten mit Morbus Crohn

Alle Patienten, die in unsere Studie aufgenommen wurden, hatten eine refraktäre Erkrankung. Diese Patienten wurden zuvor behandelt und hatten nicht verheilte kryptoglanduläre Fisteln. Die Patienten, die in diese Studie aufgenommen wurden, waren diejenigen, die nach Verabreichung von 10 mg/kg intravenösem Infliximab und Seton-Platzierung keine Besserung erzielten. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie weniger als sechs Monate lang eine Anti-TNF-α-Behandlung erhielten, keine vorherigen chirurgischen Eingriffe hatten oder eine Vorgeschichte von bösartigen Erkrankungen oder Immunschwächekrankheiten hatten. Schwangere Patienten wurden ebenfalls ausgeschlossen.

MSCs in dritter Passage 3 wurden in T175-Kolben mit D-MEM F12-Kulturmedium (Gibco), ergänzt mit Pen/Strep, Strep und 10 % Exosomen-depletiertem FBS (Gibco) für 48 Stunden bei 37 °C mit einer CO2-Konzentration von 5 kultiviert % bei und Luftfeuchtigkeit von 90 % Luftfeuchtigkeit. Unter 5 % CO2. Die konditionierten Medien von MSCs (CM) wurden gesammelt und 10 min bei 400 × g zentrifugiert, um suspendierte Zellen zu eliminieren, 30 min bei 2500 × g, um Debris und apoptotische Körper zu entfernen, und dann 120 min bei 100000 × g ultrazentrifugiert (Beckman, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die Überstände wurden gesammelt und weiter für 120 min bei 100000 × g ultrazentrifugiert. Dann wurden die Exosomen enthaltenden Pellets in PBS gelöst.

Um die Produktion von MSC-abgeleiteten Exosomen zu verifizieren, wurde der Vesikelproteingehalt durch einen kolorimetrischen Bradford-Assay (BCA) aus 100 ml CM gemessen. Die Größenverteilung von MSC-abgeleiteten Exosomen wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestimmt. Darüber hinaus wurden zur Beurteilung der Expression von CD9, CD63 und CD81 mit Durchflusszytometrie und Western Blot bestätigt. Als Reagenzien wurden FITC-Maus-Anti-CD63 (BD ​​Pharmingen) und PE-Maus-Anti-CD81 (BD Pharmingen) verwendet. Darüber hinaus wurden die Morphologie und Größe isolierter Exosomen mit TEM nach dem zuvor festgelegten Protokoll in der vorherigen Studie bewertet.

Das Verfahren wurde im Operationssaal durchgeführt, und die Patienten wurden 6 Stunden vor der Operation mit intravenöser Sedierung und Sauerstoffergänzung mit einer Maske NPO. Die Patienten wurden in Steinschnittlage gebracht. Die äußere Fistelöffnung wurde inspiziert, der Trakt palpiert und unter Verwendung eines Eisenhammer-Retraktors die innere Öffnung sichtbar gemacht. Die Partie wurde mehrere Male mit Kochsalzlösung gespült, wobei ein kleiner Katheter verwendet wurde, um Eiter und Fäkalmaterial zu entfernen. Nach der Spülung wurde eine flexible Fistelsonde in den Trakt eingeführt. Unter Verwendung der Sonde als Leitfaden injizierten wir 5 ml Exosomenlösung in das Gewebe, das die Partie umgab. Die Injektionstiefe betrug etwa 2–3 mm der Weichteile und Schließmuskeln des Anus. Nach der Injektion wurde die Traktsonde entfernt, die Patienten wurden im Operationsaufwachraum für 3 Stunden beobachtet, und die Vitalzeichen wurden überwacht. Die Patienten wurden dann auf die Operationsstation verlegt und 48 Stunden lang beobachtet. Sechs Monate nach der Injektion wurden die Patienten erneut unter Sedierung im Operationssaal zur weiteren Beurteilung untersucht.