Istukan mesenkymaalisten kantasoluista peräisin olevien eksosomien injektion turvallisuus resistentin perianaalisen fistelin hoitoon Crohnin potilailla

Kaikilla potilailla, jotka otettiin mukaan tutkimukseemme, oli refraktaarinen sairaus. Näitä potilaita hoidettiin aiemmin, ja heillä oli parantumattomia kryptoglandulaarisia fisteleitä. Tähän tutkimukseen otetut potilaat olivat sellaisia, jotka eivät parantuneet laskimonsisäisen infliksimabiannoksen 10 mg/kg ja setonin asettamisen jälkeen. Potilaat suljettiin pois, jos he olivat saaneet anti-TNF α -hoitoa alle kuuden kuukauden ajan, heillä ei ollut aikaisempaa leikkausta tai heillä oli ollut pahanlaatuisia kasvaimia tai immuunipuutossairauksia. Myös raskaana olevat potilaat suljettiin pois.

Kolmannen siirrostuksen 3 MSC:itä viljeltiin T175-pulloissa D-MEM F12 -viljelyelatusaineella (Gibco), jota oli täydennetty Pen/Strepillä, Strep:llä ja 10 % eksosomivapaalla FBS:llä (Gibco) 48 tunnin ajan 37 °C:ssa CO2-pitoisuuden ollessa 5 % at ja kosteus 90 % kosteus. Alle 5 % CO2. Käsitellyt MSC-väliaineet (CM) kerättiin ja sentrifugoitiin 10 minuuttia 400 x g:ssä suspendoituneiden solujen poistamiseksi, 30 minuuttia 2500 x g:ssä roskien ja apoptoottisten kappaleiden poistamiseksi, ja sitten ultrasentrifugoitiin 120 minuuttia 100 000 x g:ssä (Beckman, USA). Supernatantit kerättiin ja ultrasentrifugoitiin edelleen 120 minuuttia 100 000 x g:ssä. Sitten eksosomeja sisältävät pelletit liuotettiin PBS:ään.

MSC-peräisten eksosomien tuotannon tarkistamiseksi vesikkeliproteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin kolorimetrisellä määrityksellä (BCA) 100 ml:sta CM:a. MSC-peräisten eksosomien kokojakauma määritettiin dynaamisella valonsironnalla (DLS). Lisäksi CD9:n ilmentymisen arvioimiseksi CD63 ja CD81 varmistettiin virtaussytometrillä ja Western blot -analyysillä, FITC-hiiren anti-CD63:a (BD Pharmingen) ja PE-hiiren anti-CD81:tä (BD Pharmingen) käytettiin reagensseina. Lisäksi eristettyjen eksosomien morfologia ja koko arvioitiin käyttämällä TEM:ää edellisessä tutkimuksessa aiemmin asetetun protokollan mukaisesti.

Toimenpide tehtiin leikkaussalissa, ja potilaat olivat NPO:ssa 6 tuntia ennen leikkausta suonensisäisellä sedaatiolla ja happilisällä maskilla. Potilaat asetettiin litotomiaan. Fistulin ulkoinen aukko tarkastettiin, kanava tunnusteltiin ja sisäinen aukko paljastettiin käyttämällä Eisenhammer Retractoria. Erä kasteltiin suolaliuoksella useita kertoja käyttäen pientä katetria männän ja ulosteen poistamiseksi. Huuhtelun jälkeen kanavaan työnnettiin joustava fistelianturi. Käyttämällä koetinta oppaana injektoimme 5 ml eksosomiliuosta erää ympäröivään kudokseen. Injektion syvyys oli noin 2-2-3 mm peräaukon pehmytkudoksesta ja sulkijalihaksista. Injektion jälkeen kanavaanturi poistettiin, potilaita tarkkailtiin leikkauksen toipumishuoneessa 3 tunnin ajan ja elintoimintoja tarkkailtiin. Potilaat siirrettiin sitten leikkausosastolle ja niitä tarkkailtiin 48 tunnin ajan. Potilaat tutkittiin jälleen sedaatiossa leikkaussalissa lisäarviointia varten kuuden kuukauden kuluttua injektiosta.