ミトコンドリア病の診断行き詰まりとの闘い: 線維芽細胞と血球におけるトランスクリプトームのアプローチ (RNAseq)

次世代シーケンス (NGS)、特に全エクソームシーケンス (WES) またはゲノムシーケンス (WGS) は、遺伝子診断を大幅に改善する重要な技術的進歩を可能にしました。 しかし、患者の約 50% は依然として未診断であり、診断が曖昧な状態にあります。 この原因の 1 つは、転写物の発現や RNA スプライシングを変化させる病原性変異です。 これらの変異体は、深いイントロン領域または遺伝子間領域、またはコード配列、同義変異体またはミスセンス変異体に位置する可能性があり、スプライシングまたは遺伝子発現に病原性の影響を及ぼします。 これらの変異体の病原性を解釈することは非常に困難であることが多く、多くの場合、重要性が不確かな変異体 (VSI) のままです。 MM の遺伝子診断におけるトランスクリプトーム シーケンス (RNA-seq) の有用性は、近年いくつかのチームによって 10% ～ 35% の診断収率で実証されています (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. 、2018）。 MM は筋肉、心臓、脳、肝臓などのエネルギー代謝の高い組織で最も多く発現されるため、これらの研究は筋肉組織を使用して行うのが理想的です (Cummings et al. 2017)。 ただし、これらの組織の生検は入手が難しいため、ほとんどの転写研究は皮膚生検から得られた線維芽細胞を使用して行われます（Kremer et al. 2017、Saadi et al. 2022）。 実際、線維芽細胞に対する生理学的影響は無視できるものであっても、発現の喪失や異常なスプライシングなどの極端な調節欠陥が線維芽細胞で検出される可能性があります。 しかし、一部の患者はこれらの生検を拒否し、特定された変異体の病原性を確認するための機能分析が行われないため、診断が曖昧なままになる可能性があります。 RNA 研究は、PAXGene チューブ上の血球から抽出された RNA を使用して実行することもできます (Frésard et al、2019)。 抽出される RNA の量は線維芽細胞から抽出されるものよりも少ないですが、このタイプの分析では、(i) より侵襲的な手順が回避され、(ii) 細胞培養に関連する操作が回避されることで技術的時間が節約され、(iii) RNA の分析にかかる時間が節約されます。細胞培養を待たずに血液チューブから即座に抽出できるため、患者の負担が軽減されます。 Frésardらは、16の異なるメンデル病理を有する患者において、血液細胞のRNA-seqにより、検査を受けた患者の7.5％で診断が特定されたことを示した（Frésard et al、2019）。 彼らのアプローチにより、発現変異とスプライシング異常の両方が明らかになりました。

したがって、我々は、ハイスループット RNA シーケンス (RNA-Seq) を使用した転写研究を、線維芽細胞から抽出した RNA と血球から抽出した RNA について並行して、重要性が不明瞭な変異がみられるミトコンドリア病が疑われる 10 人の患者に対して実施することを提案します。候補遺伝子 (VSI+) が特定されました。

「パイロット」研究の枠組み内での RNA-Seq データの解釈を容易にするために、NGS によって以前に特定された VSI+ 患者を研究の対象とすることにしました。 候補遺伝子に変異を持っているこれらの患者では、これらの遺伝子にバイオインフォマティクス分析を集中させます。 VSI+ の解釈については、RT-PCR に基づくサンガー シークエンシングを使用した標的アプローチ、または定量的 PCR を使用した遺伝子発現の定量化も可能ですが、バリアントごとにカスタム開発が必要であり、非常に時間がかかり、かなりの費用がかかります。 RNA-seq アプローチの利点は、患者の診断戦略が均質化され、分析時間が節約され、したがって診断の迷走に費やす時間が短縮されることです。 最後に、NGS シーケンスのコストが大幅に削減されたということは、この技術がエクソーム/ゲノム シーケンスの補完として日常的に使用できることを意味します。 したがって、最終的には、VSI+ 患者だけでなく、潜在的な病原性バリアントの証拠がない場合にも、WES/WGS によって特定されたバリアントをフィルタリングするための補助として適用できる可能性があります。