Combatendo o impasse diagnóstico em doenças mitocondriais: uma abordagem transcriptômica em fibroblastos e células sanguíneas (RNAseq)

O sequenciamento de próxima geração (NGS), e em particular o sequenciamento completo do exoma (WES) ou sequenciamento do genoma (WGS), permitiu um avanço técnico significativo que melhorou consideravelmente o diagnóstico genético. No entanto, cerca de 50% dos pacientes ainda permanecem sem diagnóstico e estão no limbo diagnóstico. Uma das causas disso são variantes patogênicas que modificam a expressão do transcrito e/ou o splicing do RNA. Essas variantes podem estar localizadas em regiões intrônicas ou intergênicas profundas, ou na sequência codificante, variantes sinônimas ou missense, tendo também consequências patogênicas no splicing ou na expressão gênica. Muitas vezes é difícil interpretar a patogenicidade destas variantes, que muitas vezes permanecem variantes de significado incerto (VSI). A utilidade do sequenciamento do transcriptoma (RNA-seq) no diagnóstico genético do MM foi demonstrada nos últimos anos por várias equipes com rendimentos diagnósticos de 10% a 35% (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. 2017; Alston et al. 2017; , 2018). Esses estudos são idealmente realizados utilizando tecido muscular, já que os MMs são mais frequentemente expressos em tecidos com alto metabolismo energético, como músculo, coração, cérebro ou fígado (Cummings et al. 2017). No entanto, como as biópsias destes tecidos são difíceis de obter, a maioria dos estudos de transcrição são realizados utilizando fibroblastos obtidos a partir de biópsias de pele (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Na verdade, defeitos regulatórios extremos, como perda de expressão ou splicing aberrante, podem ser detectados em fibroblastos, mesmo que a consequência fisiológica nos fibroblastos possa ser insignificante. Contudo, alguns pacientes também recusam essas biópsias e podem permanecer no limbo diagnóstico na ausência de análise funcional para confirmar a patogenicidade das variantes identificadas. Os estudos de RNA também podem ser realizados utilizando RNA extraído de células sanguíneas em tubos PAXGene (Frésard et al, 2019). A quantidade de RNA extraído é inferior à extraída de fibroblastos, mas este tipo de análise (i) evita um procedimento mais invasivo, (ii) economiza tempo técnico ao evitar as manipulações associadas à cultura celular, e (iii) economiza tempo para o paciente, permitindo a extração imediata do tubo de sangue sem esperar pela cultura celular. Frésard et al mostraram em pacientes com 16 patologias mendelianas diferentes que o RNA-seq nas células sanguíneas identificou um diagnóstico em 7,5% dos pacientes testados (Frésard et al, 2019). Sua abordagem revelou variações de expressão e anomalias de emenda.

Propomos, portanto, a realização de um estudo transcrito utilizando sequenciação de RNA de alto rendimento (RNA-Seq), em paralelo no RNA extraído de fibroblastos e no RNA extraído de células sanguíneas, em 10 pacientes com suspeita de doença mitocondrial nos quais variantes de significado incerto em genes candidatos (VSI+) foram identificados.

Optamos por direcionar nosso estudo para pacientes com VSI+, previamente identificados por NGS, para facilitar a interpretação dos dados de RNA-Seq no âmbito de um estudo “piloto”. Nestes pacientes, que carregam variantes em genes candidatos, focaremos nossa análise bioinformática nesses genes. Para a interpretação do VSI+, uma abordagem direcionada usando sequenciamento Sanger baseado em RT-PCR, ou quantificação da expressão gênica usando PCR quantitativo, também é viável, mas requer desenvolvimento personalizado para cada variante, o que consome muito tempo e não é insignificantemente caro. A vantagem de uma abordagem RNA-seq é que ela homogeneiza a estratégia diagnóstica para os pacientes, economiza tempo de análise e, portanto, reduz o tempo gasto na divagação diagnóstica. Finalmente, a redução drástica no custo do sequenciamento NGS significa que esta técnica poderia ser usada rotineiramente como um complemento ao sequenciamento exoma/genoma. Poderia, portanto, eventualmente ser aplicado não apenas a pacientes com VSI+, mas também, na ausência de evidência de variantes potencialmente patogênicas, como um auxílio à filtragem de variantes identificadas pelo WES/WGS.