Bekämpfung der diagnostischen Sackgasse bei mitochondrialen Erkrankungen: ein transkriptomischer Ansatz bei Fibroblasten und Blutzellen (RNAseq)

Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) und insbesondere die Sequenzierung des gesamten Exoms (WES) oder Genomsequenzierung (WGS) haben einen bedeutenden technischen Fortschritt ermöglicht, der die genetische Diagnostik erheblich verbessert hat. Allerdings bleiben etwa 50 % der Patienten immer noch unerkannt und befinden sich in der diagnostischen Schwebe. Eine der Ursachen dafür sind pathogene Varianten, die die Transkriptexpression und/oder das RNA-Spleißen verändern. Diese Varianten können in tiefen intronischen oder intergenen Regionen oder in der kodierenden Sequenz, Synonym- oder Missense-Varianten lokalisiert sein und auch pathogene Auswirkungen auf das Spleißen oder die Genexpression haben. Es ist sehr oft schwierig, die Pathogenität dieser Varianten zu interpretieren, da es sich häufig um Varianten unsicherer Signifikanz (VSI) handelt. Der Nutzen der Transkriptomsequenzierung (RNA-seq) in der genetischen Diagnose von MM wurde in den letzten Jahren von mehreren Teams mit diagnostischen Ausbeuten von 10 % bis 35 % demonstriert (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al , 2018). Diese Studien werden idealerweise mit Muskelgewebe durchgeführt, da MMs am häufigsten in Geweben mit hohem Energiestoffwechsel wie Muskeln, Herz, Gehirn oder Leber exprimiert werden (Cummings et al. 2017). Da es jedoch schwierig ist, Biopsien dieser Gewebe zu erhalten, werden die meisten Transkriptstudien mit Fibroblasten durchgeführt, die aus Hautbiopsien gewonnen wurden (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Tatsächlich können in Fibroblasten extreme regulatorische Defekte wie Expressionsverlust oder fehlerhaftes Spleißen festgestellt werden, auch wenn die physiologischen Folgen für Fibroblasten möglicherweise vernachlässigbar sind. Einige Patienten lehnen diese Biopsien jedoch ebenfalls ab und bleiben möglicherweise in der diagnostischen Schwebe, da keine Funktionsanalyse zur Bestätigung der Pathogenität der identifizierten Varianten vorliegt. RNA-Studien können auch mit RNA durchgeführt werden, die aus Blutzellen in PAXGene-Röhrchen extrahiert wurde (Frésard et al, 2019). Die Menge der extrahierten RNA ist geringer als die aus Fibroblasten extrahierte, aber diese Art der Analyse vermeidet (i) ein invasiveres Verfahren, (ii) spart technische Zeit, indem die mit der Zellkultur verbundenen Manipulationen vermieden werden, und (iii) spart Zeit für die Patienten, indem die sofortige Entnahme aus dem Blutröhrchen ermöglicht wird, ohne auf die Zellkultur warten zu müssen. Frésard et al. zeigten bei Patienten mit 16 verschiedenen Mendelschen Pathologien, dass RNA-Seq auf Blutzellen bei 7,5 % der getesteten Patienten eine Diagnose identifizierte (Frésard et al., 2019). Ihr Ansatz deckte sowohl Ausdrucksvariationen als auch Spleißanomalien auf.

Wir schlagen daher vor, eine Transkriptstudie mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) parallel an aus Fibroblasten extrahierter RNA und an aus Blutzellen extrahierter RNA an 10 Patienten mit Verdacht auf eine mitochondriale Erkrankung durchzuführen, bei denen Varianten von ungewisser Bedeutung vorliegen Kandidatengene (VSI+) wurden identifiziert.

Wir haben uns entschieden, unsere Studie auf Patienten mit VSI+ auszurichten, die zuvor von NGS identifiziert wurden, um die Interpretation der RNA-Seq-Daten im Rahmen einer „Pilotstudie“ zu erleichtern. Bei diesen Patienten, die Varianten in Kandidatengenen tragen, werden wir unsere bioinformatische Analyse auf diese Gene konzentrieren. Für die Interpretation von VSI+ ist auch ein gezielter Ansatz mittels Sanger-Sequenzierung auf Basis von RT-PCR oder die Quantifizierung der Genexpression mittels quantitativer PCR möglich, erfordert jedoch eine individuelle Entwicklung für jede Variante, was sehr zeitaufwändig und nicht unerheblich teuer ist. Der Vorteil eines RNA-seq-Ansatzes besteht darin, dass er die diagnostische Strategie für Patienten homogenisiert, Analysezeit spart und somit den Zeitaufwand für diagnostisches Wandern reduziert. Schließlich bedeutet die drastische Reduzierung der Kosten der NGS-Sequenzierung, dass diese Technik routinemäßig als Ergänzung zur Exom-/Genomsequenzierung eingesetzt werden könnte. Es könnte daher letztendlich nicht nur bei Patienten mit VSI+ angewendet werden, sondern auch, wenn keine Hinweise auf potenziell pathogene Varianten vorliegen, als Hilfsmittel zur Filterung der durch WES/WGS identifizierten Varianten.