Bekjempelse av det diagnostiske uføret i mitokondrielle sykdommer: en transkriptomisk tilnærming i fibroblaster og blodceller (RNAseq)

Neste generasjons sekvensering (NGS), og spesielt hele eksomsekvensering (WES) eller genomsekvensering (WGS), har muliggjort et betydelig teknisk fremskritt som har forbedret genetisk diagnostikk betraktelig. Imidlertid er rundt 50 % av pasientene fortsatt udiagnostisert og er i diagnostisk limbo. En av årsakene til dette er patogene varianter som modifiserer transkripsjonsuttrykk og/eller RNA-spleising. Disse variantene kan være lokalisert i dype introniske eller intergene regioner, eller i kodingssekvensen, synonyme eller missense-varianter, og også ha patogene konsekvenser på spleising eller genuttrykk. Det er svært ofte vanskelig å tolke patogenisiteten til disse variantene, som ofte forblir varianter av usikker betydning (VSI). Nytten av transkriptomsekvensering (RNA-seq) i den genetiske diagnosen MM har blitt demonstrert de siste årene av flere team med diagnostiske utbytter på 10 % til 35 % (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Disse studiene utføres ideelt sett ved bruk av muskelvev, da MM-er oftest kommer til uttrykk i vev med høy energimetabolisme som muskel, hjerte, hjerne eller lever (Cummings et al. 2017). Men siden biopsier av disse vevene er vanskelige å få tak i, utføres de fleste transkripsjonsstudier ved bruk av fibroblaster hentet fra hudbiopsier (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Faktisk kan ekstreme regulatoriske defekter som tap av uttrykk eller avvikende spleising påvises i fibroblaster, selv om den fysiologiske konsekvensen på fibroblaster kan være ubetydelig. Noen pasienter nekter imidlertid også disse biopsiene og kan forbli i diagnostisk limbo i fravær av funksjonell analyse for å bekrefte patogenisiteten til de identifiserte variantene. RNA-studier kan også utføres ved å bruke RNA ekstrahert fra blodceller på PAXGene-rør (Frésard et al, 2019). Mengden RNA ekstrahert er lavere enn den som ekstraheres fra fibroblaster, men denne typen analyse (i) unngår en mer invasiv prosedyre, (ii) sparer teknisk tid ved å unngå manipene forbundet med cellekultur, og (iii) sparer tid for pasient ved å muliggjøre umiddelbar ekstraksjon fra blodrøret uten å vente på cellekultur. Frésard et al viste hos pasienter med 16 forskjellige mendelske patologier at RNA-seq på blodceller identifiserte en diagnose hos 7,5 % av pasientene som ble testet (Frésard et al, 2019). Tilnærmingen deres avslørte både uttrykksvariasjoner og skjøteavvik.

Vi foreslår derfor å gjennomføre en transkripsjonsstudie ved bruk av high-throughput RNA-sekvensering (RNA-Seq), parallelt på RNA ekstrahert fra fibroblaster og på RNA ekstrahert fra blodceller, på 10 pasienter med mistenkt mitokondriell sykdom hos hvem varianter av usikker betydning i kandidatgener (VSI+) er identifisert.

Vi valgte å målrette studien vår på pasienter med VSI+, tidligere identifisert av NGS, for å lette tolkningen av RNA-Seq-dataene innenfor rammen av en "pilot"-studie. Hos disse pasientene, som bærer varianter av kandidatgener, vil vi fokusere vår bioinformatikkanalyse på disse genene. For tolkning av VSI+ er en målrettet tilnærming ved bruk av Sanger-sekvensering basert på RT-PCR, eller kvantifisering av genuttrykk ved bruk av kvantitativ PCR, også mulig, men krever tilpasset utvikling for hver variant, noe som er svært tidkrevende og ikke ubetydelig kostbart. Fordelen med en RNA-seq-tilnærming er at den homogeniserer diagnosestrategien for pasienter, sparer analysetid og reduserer derfor tiden brukt på diagnostisk vandring. Til slutt betyr den drastiske reduksjonen i kostnadene for NGS-sekvensering at denne teknikken kan brukes rutinemessig som et komplement til eksom/genomsekvensering. Den kan derfor til slutt brukes ikke bare på pasienter med VSI+, men også, i mangel av bevis på potensielt patogene varianter, som et hjelpemiddel for å filtrere varianter identifisert av WES/WGS.