Combattre l'impasse diagnostique dans les maladies mitochondriales : une approche transcriptomique dans les fibroblastes et les cellules sanguines (RNAseq)

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), et notamment le séquençage de l’exome entier (WES) ou le séquençage du génome (WGS), a permis une avancée technique significative qui a considérablement amélioré le diagnostic génétique. Cependant, environ 50 % des patients ne sont toujours pas diagnostiqués et se trouvent dans une impasse diagnostique. L’une des causes de ce phénomène réside dans les variantes pathogènes qui modifient l’expression du transcrit et/ou l’épissage de l’ARN. Ces variants peuvent être localisés dans des régions introniques profondes ou intergéniques, ou dans la séquence codante, des variants synonymes ou faux-sens, ayant également des conséquences pathogènes sur l'épissage ou l'expression des gènes. Il est très souvent difficile d’interpréter le pouvoir pathogène de ces variants, qui restent souvent des variants de signification incertaine (VSI). L'utilité du séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans le diagnostic génétique du MM a été démontrée ces dernières années par plusieurs équipes avec des rendements diagnostiques de 10 % à 35 % (Cummings et al. 2017 ; Kremer et al. 2017 ; Alston et al. , 2018). Ces études sont idéalement réalisées sur des tissus musculaires, car les MM sont le plus souvent exprimés dans des tissus à métabolisme énergétique élevé, tels que les muscles, le cœur, le cerveau ou le foie (Cummings et al. 2017). Cependant, comme les biopsies de ces tissus sont difficiles à obtenir, la plupart des études de transcription sont réalisées à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsies cutanées (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). En effet, des défauts de régulation extrêmes tels qu'une perte d'expression ou un épissage aberrant peuvent être détectés dans les fibroblastes, même si la conséquence physiologique sur les fibroblastes peut être négligeable. Cependant, certains patients refusent également ces biopsies et peuvent rester dans le flou diagnostique en l’absence d’analyse fonctionnelle permettant de confirmer le pouvoir pathogène des variants identifiés. Des études sur l'ARN peuvent également être réalisées à partir d'ARN extraits de cellules sanguines sur des tubes PAXGene (Frésard et al, 2019). La quantité d'ARN extraite est inférieure à celle extraite des fibroblastes, mais ce type d'analyse (i) évite une procédure plus invasive, (ii) permet de gagner du temps technique en évitant les manipulations liées à la culture cellulaire, et (iii) permet de gagner du temps pour la patient en permettant une extraction immédiate du tube de sang sans attendre la culture cellulaire. Frésard et al ont montré chez des patients atteints de 16 pathologies mendéliennes différentes que le séquençage d'ARN sur les cellules sanguines identifiait un diagnostic chez 7,5 % des patients testés (Frésard et al, 2019). Leur approche a révélé à la fois des variations d’expression et des anomalies d’épissage.

Nous proposons donc de réaliser une étude de transcription par séquençage d'ARN à haut débit (RNA-Seq), en parallèle sur des ARN extraits de fibroblastes et sur des ARN extraits de cellules sanguines, sur 10 patients avec suspicion de maladie mitochondriale chez lesquels des variants de signification incertaine chez des gènes candidats (VSI+) ont été identifiés.

Nous avons choisi de cibler notre étude sur des patients atteints de VSI+, préalablement identifiés par NGS, pour faciliter l'interprétation des données RNA-Seq dans le cadre d'une étude « pilote ». Chez ces patients, porteurs de variants dans des gènes candidats, nous concentrerons notre analyse bioinformatique sur ces gènes. Pour l’interprétation de VSI+, une approche ciblée utilisant le séquençage de Sanger basé sur la RT-PCR, ou la quantification de l’expression génique par PCR quantitative, est également réalisable, mais nécessite un développement personnalisé pour chaque variante, ce qui prend beaucoup de temps et coûte cher. L’avantage d’une approche RNA-seq est qu’elle homogénéise la stratégie diagnostique des patients, fait gagner du temps d’analyse et réduit donc le temps passé en errance diagnostique. Enfin, la réduction drastique du coût du séquençage NGS signifie que cette technique pourrait être utilisée en routine en complément du séquençage exome/génome. Elle pourrait donc à terme être appliquée non seulement aux patients atteints de VSI+ mais également, en l’absence de preuves de variants potentiellement pathogènes, pour aider au filtrage des variants identifiés par WES/WGS.