Diagnostisen umpikujan torjunta mitokondriosairauksissa: transkriptominen lähestymistapa fibroblasteissa ja verisoluissa (RNAseq)

Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) ja erityisesti koko eksomesekvensointi (WES) tai genomisekvenssi (WGS) on mahdollistanut merkittävän teknisen edistyksen, joka on parantanut huomattavasti geneettistä diagnostiikkaa. Noin 50 % potilaista on kuitenkin edelleen diagnosoimattomia ja diagnostisessa limbossa. Yksi syistä tähän on patogeeniset variantit, jotka modifioivat transkriptin ilmentymistä ja/tai RNA:n silmukointia. Nämä variantit voivat sijaita syvillä intronisilla tai intergeenisillä alueilla tai koodaavassa sekvenssissä, synonyymeissä tai missense-varianteissa, joilla on myös patogeenisiä seurauksia silmukointiin tai geeniekspressioon. On hyvin usein vaikeaa tulkita näiden muunnelmien patogeenisyyttä, koska ne ovat usein epävarman merkityksen variantteja (VSI). Useat ryhmät ovat viime vuosina osoittaneet transkriptomisekvensoinnin (RNA-seq) hyödyllisyyden MM:n geneettisessä diagnoosissa 10–35 prosentin diagnostisilla tuloksilla (Cummings ym. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Nämä tutkimukset tehdään ihanteellisesti lihaskudoksella, koska MM:t ilmenevät useimmiten kudoksissa, joissa on korkea energia-aineenvaihdunta, kuten lihaksissa, sydämessä, aivoissa tai maksassa (Cummings et al. 2017). Koska näiden kudosten biopsiat on kuitenkin vaikea saada, useimmat transkriptiotutkimukset suoritetaan käyttämällä ihobiopsioista saatuja fibroblasteja (Kremer ym. 2017, Saadi et al., 2022). Todellakin, äärimmäisiä säätelyvirheitä, kuten ilmentymisen menetys tai poikkeava silmukointi, voidaan havaita fibroblasteissa, vaikka fysiologiset seuraukset fibroblasteihin voivat olla mitättömät. Jotkut potilaat kuitenkin myös kieltäytyvät näistä biopsiasta ja voivat jäädä diagnostiseen hämärään ilman toiminnallista analyysiä, joka vahvistaa tunnistettujen varianttien patogeenisuuden. RNA-tutkimuksia voidaan tehdä myös käyttämällä RNA:ta, joka on uutettu verisoluista PAXGene-putkissa (Frésard et al, 2019). Uutetun RNA:n määrä on pienempi kuin fibroblasteista uutetun, mutta tämäntyyppinen analyysi (i) välttää invasiivisemman toimenpiteen, (ii) säästää teknistä aikaa välttämällä soluviljelyyn liittyviä manipulaatioita ja (iii) säästää aikaa potilaalle mahdollistamalla välitön poisto veriputkesta odottamatta soluviljelyä. Frésard ym. osoittivat potilailla, joilla oli 16 erilaista Mendelin patologiaa, että verisolujen RNA-seq tunnisti diagnoosin 7,5 %:lla testatuista potilaista (Frésard et al, 2019). Heidän lähestymistapansa paljasti sekä ilmentymisvariaatioita että silmukointihäiriöitä.

Siksi ehdotamme transkriptiotutkimuksen suorittamista käyttämällä korkean suorituskyvyn RNA-sekvensointia (RNA-Seq) rinnakkain fibroblasteista erotetulla RNA:lla ja verisoluista uutetulla RNA:lla 10 potilaalla, joilla epäillään mitokondriosairautta ja joilla on epävarman merkityksen variantteja. ehdokasgeenit (VSI+) on tunnistettu.

Päätimme kohdistaa tutkimuksemme potilaisiin, joilla on NGS:n aiemmin tunnistama VSI+, helpottaaksemme RNA-Seq-tietojen tulkintaa "pilottitutkimuksen" puitteissa. Näillä potilailla, joilla on muunnelmia ehdokasgeeneissä, keskitämme bioinformatiikan analyysimme näihin geeneihin. VSI+:n tulkinnassa on myös mahdollista käyttää kohdennettua lähestymistapaa, jossa käytetään RT-PCR:ään perustuvaa Sanger-sekvensointia tai geenin ilmentymisen kvantitointia kvantitatiivisella PCR:llä, mutta vaatii räätälöidyn kehityksen jokaiselle variantille, mikä on erittäin aikaa vievää eikä merkityksettömän kallista. RNA-seq-lähestymistavan etuna on, että se homogenisoi potilaiden diagnostisen strategian, säästää analyysiaikaa ja vähentää siten diagnostiseen vaellukseen kuluvaa aikaa. Lopuksi, NGS-sekvensoinnin kustannusten jyrkkä aleneminen tarkoittaa, että tätä tekniikkaa voitaisiin käyttää rutiininomaisesti täydennyksenä exome/genomi-sekvensoinnille. Siksi sitä voitaisiin lopulta soveltaa paitsi potilaisiin, joilla on VSI+, myös, jos todisteita ei ole mahdollisesti patogeenisistä varianteista, myös apuna WES/WGS:n tunnistamien varianttien suodattamisessa.